【摘要】：牛呼吸道疾病綜合征(BRDC)的主要病毒性病原有牛副流感病毒3型(BPIV3)、牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)和牛呼吸道合胞體病毒(BRSV),每年給全球的養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。其中BPIV3是主要的病毒性病原,為副黏病毒科(Paramyxoviridae)呼吸道病毒屬(Respirovirus)成員。BPIV3為單股負鏈RNA病毒,通常被稱為“運輸熱”病毒。BPIV3分為三個基因型,分別為A型、B型和C型。BPIV3主要引起成年牛和犢牛的肺炎、支氣管肺炎和被感染肺葉的實變。臨床上主要表現(xiàn)為發(fā)熱、流淚、流鼻涕和呼吸加快等癥狀。該病毒自從1959年在美國首次分離報道以來,現(xiàn)在全世界流行。朱遠茂等(2011)在我國山東省首次分離到新基因C型的BPIV3。目前雖然我國對BPIV3有了一些研究,但國內(nèi)目前還沒有商品化的疫苗及檢測試劑。本研究利用BPIV3的全病毒免疫6~8周齡雌性Balb/c小鼠,經(jīng)3次免疫后取其脾細胞與骨髓瘤細胞(Sp2/0)進行融合。采用以核衣殼蛋白(NP)為包被抗原的間接ELISA進行陽性雜交瘤細胞的篩選,通過3次克隆篩選獲得7株穩(wěn)定分泌BPIV3 NP單克隆抗體(m Ab)的雜交瘤細胞株2G7、6F8、6H8、7G5、7G8、7G9、7H5。這些雜交瘤細胞制備的腹水效價均在1×105到1×107。經(jīng)間接ELISA、Western blotting和間接免疫熒光試驗(IFA)檢測表明其具有良好的反應性和特異性�？贵w亞類鑒定結(jié)果均為Ig G1/κ。選取效價高的6F8、7G5、7G8、7G9、7H5等5株單抗,利用原核表達一系列重疊的NP重組蛋白對NP蛋白進行表位鑒定,結(jié)果表明:單抗6F8識別的表位為428ESRGDQDQ435,單抗7G5、7G8、7G9、7H5識別的表位為407FYKPTGG413。同時以3%的明膠加5%的脫脂乳為封閉液,6F8為包被抗體,HRP標記的7G9為檢測抗體建立了雙抗夾心ELISA,用于檢測病原BPIV3。以30份已確定的BPIV3陰性樣品的ELISA OD值為參照,確定了cut-off值為0.252。當OD450值大于0.252時,判定檢測樣品為陽性;等于或低于該值判定為陰性。特異性試驗結(jié)果表明,該ELISA只與BPIV3反應,不與牛傳染性鼻氣管炎病毒、牛病毒性腹瀉病毒、牛呼吸道合胞體病毒和牛腺病毒3型反應。敏感性試驗表明該方法檢測病毒的最低限度為103.36 TCID50/0.1ml。經(jīng)現(xiàn)有的34份陽性牛鼻拭子和陽性牛肺臟經(jīng)RT-PCR驗證,該方法與RT-PCR的符合率為97%。綜上所述,本研究成功制備了7株針對NP蛋白的單克隆抗體,并對其中的效價高的5株單克隆抗體進行了表位鑒定,并鑒定出兩個抗原表位。用針對上述兩個不同抗原表位的單抗6F8和7G9建立了雙抗夾心ELISA。特異性和敏感性試驗及與RT-PCR的符合率試驗表明該雙抗夾心ELISA具有較好的表現(xiàn),可試用于BPIV3的檢測。同時,本研究為BPIV3 NP蛋白生物學結(jié)構(gòu)與功能研究及病毒致病性的研究奠定了基礎。
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65
【圖文】：

ESRGDQDQ、FHKPTGG；BPIV3b 的DSKGDQDQ、FQKPTGG和 HPIV3 的428EHRSDQER435、407FHKPTGG413這 6 條短肽，用間接 ELISA 分析 6F8 和 7G5 是否已其它病毒株的表位反應。3.1.6 抗原表位的血清學分析為了研究表位是否是 BPIV3 的優(yōu)勢表位，用鑒定出的抗原表位多肽包被 ELISA 板，用 18 份來自免疫BPIV3 SD0835的牛陽性血清做為一抗，用間接ELISA方法鑒定，ELISA方法同2.1.8，同時設陰性對照。3.2 結(jié)果3.2.1 NP 蛋白的截短表達與抗原表位的初步鑒定將截短的 NP 蛋白經(jīng)單克隆抗體 Western blot 鑒定，單克隆抗體 7G5 的表位初步定位在403-415 aa，而單克隆抗體 6F8 能與多肽 420-435 aa 和 428-440 aa 反應，因此其抗原表位初步定為在 428-435aa。其中 7G5、7G8、7G9、7H5 均針對相同的抗原表位。NP 截短方案如圖所示：

農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第三章 NP 蛋白的抗原表位鑒定.4 單克隆抗體的跨種反應分析根據(jù) BPIV3a、BPIV3b、BPIV3c 和 HPIV3 基因序列按照 3.1.3 方法，分別表達 BPIV3a 的SRGDQDQ435、407FHKPTGG413；BPIV3b 的428DSKGDQDQ435、407FQKPTGG413和 HPIV3 的HRSDQER435、407FHKPTGG413這 6 條短肽，用間接 ELISA 分析，結(jié)果顯示 mAb 7G5 與 BPIV3aPIV3 有交叉反應；而 mAb 6F8 只能與 BPIV3a 有交叉反應。該結(jié)果表明兩個表位均屬于相守的表位。

ESRGDQDQ、FHKPTGG；BPIV3b 的DSKGDQDQ、FQKPTGG和 HPIV3 的428EHRSDQER435、407FHKPTGG413這 6 條短肽，用間接 ELISA 分析 6F8 和 7G5 是否已其它病毒株的表位反應。3.1.6 抗原表位的血清學分析為了研究表位是否是 BPIV3 的優(yōu)勢表位，用鑒定出的抗原表位多肽包被 ELISA 板，用 18 份來自免疫BPIV3 SD0835的牛陽性血清做為一抗，用間接ELISA方法鑒定，ELISA方法同2.1.8，同時設陰性對照。3.2 結(jié)果3.2.1 NP 蛋白的截短表達與抗原表位的初步鑒定將截短的 NP 蛋白經(jīng)單克隆抗體 Western blot 鑒定，單克隆抗體 7G5 的表位初步定位在403-415 aa，而單克隆抗體 6F8 能與多肽 420-435 aa 和 428-440 aa 反應，因此其抗原表位初步定為在 428-435aa。其中 7G5、7G8、7G9、7H5 均針對相同的抗原表位。NP 截短方案如圖所示：

【參考文獻】

相關碩士學位論文 前2條

1 史鴻飛;牛副流感病毒3型山東分離株核衣殼蛋白表達鑒定、多抗制備及應用[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2010年

2 呂闖;牛副流感病毒3型NP單抗制備及固相阻斷ELISA的建立和應用[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2012年

本文編號：2784091