【摘要】：狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)感染哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system,CNS)的傳染性疾病�？袢∈侨诵蠊不疾�,病死率極高,一旦出現(xiàn)臨床癥狀,死亡率高達(dá)100%。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),全球范圍內(nèi)每年有超過(guò)5萬(wàn)人死于狂犬病,但絕大多數(shù)病例發(fā)生在亞洲和非洲等發(fā)展中國(guó)家。狂犬病病毒可以感染幾乎所有的溫血?jiǎng)游?野生動(dòng)物是其主要的儲(chǔ)存宿主,人和各種哺乳動(dòng)物為傳播宿主。帶毒動(dòng)物唾液中具有感染性的病毒粒子經(jīng)抓咬撓傷造成宿主皮膚或粘膜受損隨后侵入機(jī)體,對(duì)CNS侵染隨后發(fā)病死亡。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long-chain noncoding RNA,lncRNA)是一種長(zhǎng)度大于200 nt,缺乏閱讀框且不編碼蛋白質(zhì)的RNA分子,它在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有分布。lncRNA雖然不編碼蛋白質(zhì),但卻參與DNA甲基化、轉(zhuǎn)錄激活調(diào)控并干擾、細(xì)胞核內(nèi)運(yùn)輸翻譯等重要調(diào)控過(guò)程。lncRNA可通過(guò)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的調(diào)控以及對(duì)基因進(jìn)行表觀遺傳學(xué)修飾。機(jī)體抗RABV感染主要依靠固有免疫,尤其是I型干擾素反應(yīng)。病毒感染后,體內(nèi)細(xì)胞表面受體和胞內(nèi)受體可識(shí)別相關(guān)模式分子,激活信號(hào)通路并誘導(dǎo)細(xì)胞分泌I型干擾素。越來(lái)越多的證據(jù)表明,lncRNA在宿主抗病毒反應(yīng)、固有免疫中起重要的調(diào)節(jié)作用。然而,對(duì)RABV誘導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答中的lncRNA的表達(dá)譜和功能尚不清楚。因此闡述RABV感染誘導(dǎo)的lncRNA表達(dá)譜變化對(duì)深入探索RABV的致病機(jī)制及其防治策略具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平和小鼠腦組織水平上通過(guò)小RNA測(cè)序分析RABV感染中l(wèi)ncRNA和mRNA表達(dá)譜。首先利用SRV9和CVS11兩種病毒分別感染BHK21細(xì)胞,感染12 h,24 h,48 h后提取總RNA,構(gòu)建文庫(kù),測(cè)序分析lncRNA和mRNA的表達(dá)譜。結(jié)果顯示,與未感染組相比感染CVS11組有940個(gè)lncRNA出現(xiàn)差異表達(dá),而感染SRV9組有946個(gè)lncRNA出現(xiàn)差異表達(dá)。在感染BHK21細(xì)胞的mRNA表達(dá)譜中,與未感染組相比感染SRV9病毒組有5984個(gè)mRNA出現(xiàn)差異表達(dá),感染CVS11病毒組有5674個(gè)mRNA出現(xiàn)差異表達(dá)(P0.05)。GO富集分析顯示,在CVS11組感染48 h后,觀察到lncRNA的靶基因?qū)?xì)胞應(yīng)答、髓樣樹(shù)突細(xì)胞活化、巨噬細(xì)胞因子產(chǎn)生的調(diào)節(jié)和趨化因子受體活性的正調(diào)節(jié)顯著富集,而在SRV9組感染48 h后,lncRNA的靶基因?qū)π盘?hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),蛋白激酶和胚胎形態(tài)發(fā)生的調(diào)節(jié)顯著富集。KEGG富集分析結(jié)果顯示CVS11組感染48 h后,lncRNA靶基因有16個(gè)KEGG通路顯著富集,其中包括涉及免疫應(yīng)答的途徑、病毒致癌作用、FoxO信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路等;在SRV9感染組中也觀察到類(lèi)似的結(jié)果。這些發(fā)現(xiàn)表明lncRNA在RABV感染期間調(diào)節(jié)免疫反應(yīng),通過(guò)調(diào)節(jié)其鄰近的蛋白質(zhì)編碼基因來(lái)對(duì)病毒感染作出反應(yīng)。本研究選取了差異表達(dá)lncRNA和mRNA進(jìn)行了RT-qPCR驗(yàn)證。其次利用CVS11狂犬毒株感染小鼠腦組織,在感染第八天發(fā)病時(shí)取小鼠腦組織,提取總RNA,構(gòu)建文庫(kù),測(cè)序分析lncRNA和mRNA的表達(dá)譜。結(jié)果表明,與未感染組相比CVS11感染組共有140個(gè)lncRNA差異表達(dá)。染色體7號(hào),12號(hào)和16號(hào)的lncRNA差異變化最大;染色體18號(hào),19號(hào)和染色體X的lncRNA差異變化最小。同時(shí)我們檢測(cè)了CVS11毒株感染小鼠腦組織后mRNA的表達(dá)譜變化,結(jié)果表明,與未感染小鼠相比CVS11感染組有3807個(gè)lncRNA差異表達(dá)基因(FC≥2,P0.05)。染色體2號(hào),7號(hào)和11號(hào)mRNA差異表達(dá)最顯著,染色體16號(hào)和18號(hào)mRNA差異較為顯著。GO分析表明lncRNA上游或下游100 kb的位置同位基因編碼蛋白高度富集。差異表達(dá)的lncRNA共定位的基因高度富集在如氮化合物的解毒、氮化合物的細(xì)胞解毒和硝基苯的代謝過(guò)程等生物過(guò)程中。KEGG分析結(jié)果顯示,差異表達(dá)的lncRNA靶點(diǎn)參與Toll樣受體、NF-κB、MAPK、趨化因子、單純皰疹和流感A感染等重要信號(hào)通路。這些發(fā)現(xiàn)表明lncRNA在RABV感染期間參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。隨后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證差異表達(dá),結(jié)果顯示與小RNA測(cè)序分析RABV感染后差異表達(dá)一致。本研究通過(guò)RABV感染細(xì)胞和小鼠,分別在體外和體內(nèi)水平分析lncRNA和mRNA表達(dá)譜變化,并選擇差異表達(dá)lncRNA和mRNA進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證�；谏飳W(xué)信息分析,在體外和體內(nèi)水平初步明確RABV感染誘導(dǎo)宿主的免疫應(yīng)答路徑。目前,尚未見(jiàn)RABV感染宿主lncRNA表達(dá)譜變化的研究。本研究為闡述RABV的免疫逃逸機(jī)制和致病機(jī)理提供數(shù)據(jù)支持。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S852.65
【圖文】：

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)碩士學(xué)位論文 概述V 病原學(xué)特征于彈狀病毒科(rhabdoviridae)，狂犬病毒屬(lyssavirus)的單股復(fù) 75~80 nm，長(zhǎng) 175~200 nm，會(huì)隨不同毒株發(fā)生變化[5, 6]。病毒形形，另一端平坦或略凹的典型特征。內(nèi)層為核殼，內(nèi)部為核心，狀凸起，凸起物遠(yuǎn)端為槌狀。螺旋對(duì)稱(chēng)的核衣殼由單股 RNA 和整個(gè)病毒表面呈蜂窩狀的六角形結(jié)構(gòu)[8]。RABV 可以在多種細(xì)胞動(dòng)物模型例如鼠腦內(nèi)接種來(lái)獲取高濃度的病毒，RABV 能耐受低6oC 時(shí) 15~30 min 或 100oC 時(shí) 2 min 即可滅活。強(qiáng)酸堿、紫外線波均可殺滅病毒，0.01% 碘液和 1%~2% 的肥皂水等亦能使病毒下可長(zhǎng)期保存。對(duì)常規(guī)有機(jī)溶劑敏感，一般抗生素對(duì)狂犬病病毒

圖 1-2 狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白示意圖[15]Figure 1-2 Schematic representation of rabies virus structural protein[15]RABV 與宿主免疫應(yīng)答毒侵入機(jī)體后，首先會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗病毒作用的免疫應(yīng)答過(guò)程，包括先天性免疫免疫反應(yīng)。先天性免疫首先幫助宿主抵抗病毒感染，它包括干擾素(interferon, IFN)胞吞噬功能的增強(qiáng)、炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生等。經(jīng)感染后，IFN 介導(dǎo)的信號(hào)通路和細(xì)胞轉(zhuǎn)所參與的基因上調(diào)，例如干擾素信號(hào)通路基因和干擾素調(diào)節(jié)因子等[16]。隨著先天性表達(dá)的提高，病毒可引起炎性細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤(rùn)可并造成強(qiáng)烈炎癥反應(yīng)。隨毒致病性的免疫反應(yīng)，但隨著神經(jīng)細(xì)胞的損壞，同時(shí)也會(huì)伴隨著一些病理變化的出現(xiàn)RABV 的 N 蛋白的超抗原作用能激活 T 淋巴細(xì)胞并刺激機(jī)體對(duì)無(wú)關(guān)抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)夠加重炎癥反應(yīng)，還能誘導(dǎo)自身免疫腦脊髓炎的產(chǎn)生[17, 18]。因此，在產(chǎn)生過(guò)度免疫況下，經(jīng)免疫反應(yīng)介導(dǎo)而導(dǎo)致嚴(yán)重?fù)p傷 CNS 組織，引起免疫反應(yīng)導(dǎo)致機(jī)體死亡[1, 19lncRNA 概述 lncRNA 生物學(xué)特征及分類(lèi)

mRNA）；縱坐標(biāo)表達(dá)水平。ncRNA, mRNA); ordinate expression level.圖 3-9 FPKM 法分析 ncRNA 基因和 mRNA 基因表達(dá)水a(chǎn)lysis of lncRNA gene and mRNA expression level by AF蛋白質(zhì)的 RNA 相比，lncRNA 在轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度和 ORFs 中A 和 lncRNA 之間的外顯子數(shù)目的顯著差異，大多數(shù) 數(shù) mRNA 含有多達(dá) 20 個(gè)外顯子。大多數(shù) mRNA 的 ORB C

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2783557