【摘要】：捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)會(huì)引起嚴(yán)重的牛羊寄生蟲(chóng)病,寄生于宿主真胃,造成幼畜死亡,帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)病的防控仍然是以藥物預(yù)防為主,但線蟲(chóng)耐藥問(wèn)題的日益嚴(yán)重,迫切需要探索新的防控措施和干預(yù)靶點(diǎn)。捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)經(jīng)歷自由生活階段和寄生階段,感染期幼蟲(chóng)為三期幼蟲(chóng)(L3),當(dāng)L3幼蟲(chóng)經(jīng)口感染宿主后,約3天到達(dá)皺胃,然后鉆入皺胃黏膜下發(fā)育至四期幼蟲(chóng)(L4)后再鉆出黏膜定植于皺胃表面發(fā)育至成蟲(chóng)。鉆入胃黏膜下方是捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)入侵過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)。透明質(zhì)酸酶(HAase)能夠降解胞外黏多糖透明質(zhì)酸,鉤蟲(chóng)相關(guān)的研究表明在入侵過(guò)程中發(fā)揮了作用,而且體外培養(yǎng)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)時(shí),在L3幼蟲(chóng)發(fā)育至L4幼蟲(chóng)的早期過(guò)程中,能夠向體外釋放透明質(zhì)酸酶水解透明質(zhì)酸。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究工作表明,輻照后捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)的成蟲(chóng)發(fā)育率降低,且下調(diào)透明質(zhì)酸酶基因的表達(dá)。因此我們推測(cè),透明質(zhì)酸酶的表達(dá)量與捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)的毒力存在聯(lián)系�；诖宋覀冮_(kāi)展了捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)透明質(zhì)酸酶功能的初步研究工作。首先根據(jù)公布在GenBank上的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)透明質(zhì)酸酶的全基因序列,分析表明透明質(zhì)酸酶基因編碼511個(gè)氨基酸,理論分子量為57kD,利用signalP預(yù)測(cè)顯示存在信號(hào)肽。PCR擴(kuò)增目的基因序列,經(jīng)雙酶切、測(cè)序鑒定后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)并通過(guò)Western blot分析其免疫原性;通過(guò)免疫組化的方法鑒定透明質(zhì)酸酶在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)L3幼蟲(chóng)中的分布情況;最后用RNA干擾技術(shù),針對(duì)透明質(zhì)酸酶基因設(shè)計(jì)并合成特異性siRNA,通過(guò)電轉(zhuǎn)方式將siRNA導(dǎo)入捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)感染性L3幼蟲(chóng)體內(nèi),利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析透明質(zhì)酸酶基因在L3幼蟲(chóng)中的轉(zhuǎn)錄抑制效果;將透明質(zhì)酸酶特異性siRNA電轉(zhuǎn)導(dǎo)入L3幼蟲(chóng)24h后感染綿羊皺胃外植體,檢測(cè)透明質(zhì)酸酶基因沉默后蟲(chóng)體對(duì)皺胃組織的侵入率,并且對(duì)L3幼蟲(chóng)入侵后的皺胃外植體進(jìn)行組織切片觀察;同時(shí)將透明質(zhì)酸酶特異性siRNA電轉(zhuǎn)導(dǎo)入L3幼蟲(chóng)24h后感染綿羊,定期采集綿羊糞便檢查蟲(chóng)卵數(shù),第35d后剖檢綿羊皺胃,檢查荷蟲(chóng)數(shù)以及成蟲(chóng)形態(tài)及體表?yè)p傷。初步結(jié)果表明:western-bolt結(jié)果表明重組HC-HAase有良好的免疫原性,而且免疫組化結(jié)果顯示HAase在蟲(chóng)體中主要分布于頭部,為證明該酶在入侵時(shí)發(fā)揮重要作用提供有效依據(jù);電轉(zhuǎn)24h后實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)L3幼蟲(chóng)透明質(zhì)酸酶基因的表達(dá)量,試驗(yàn)組中透明質(zhì)酸酶基因的相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(p0.05),通過(guò)電轉(zhuǎn)法將透明質(zhì)酸酶基因特異性siRNA導(dǎo)入脫鞘捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)L3幼蟲(chóng)后能有效降低透明質(zhì)酸酶的酶活性單位。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明將透明質(zhì)酸酶基因干擾后捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)L3幼蟲(chóng)對(duì)胃組織外植體的入侵率為9.45%,而對(duì)照組為53.62%。動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明脫鞘捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)L3幼蟲(chóng)經(jīng)過(guò)siRNA干擾后感染綿羊18-32天檢測(cè)糞便中蟲(chóng)卵數(shù)量,干擾組綿羊的每克糞便蟲(chóng)卵數(shù)明顯低于對(duì)照組;35天后剖檢皺胃內(nèi)成蟲(chóng)數(shù),對(duì)照組蟲(chóng)體定植率為77.1%,實(shí)驗(yàn)組為39.7%,且兩組存在顯著差異(P0.01);捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)L3幼蟲(chóng)可能通過(guò)分泌透明質(zhì)酸酶分解宿主黏膜組織,有利于蟲(chóng)體侵入宿主黏膜,進(jìn)而促進(jìn)蟲(chóng)體在宿主黏膜中的定植。透明質(zhì)酸酶作為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)入侵時(shí)的關(guān)鍵毒力因子,其功能性研究,有利于對(duì)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)病的防治。
【學(xué)位授予單位】：上海師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.731
【圖文】：

上海師范皺胃黏膜下發(fā)育至 L4 后再鉆出黏膜定植，30d 時(shí)達(dá)到產(chǎn)卵高峰，產(chǎn)卵時(shí)間一般維持于皺胃（圖 1-1）。捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)以吸食宿主每天可以吸食 30ml 血液，造成宿主貧血，功能，使宿主貧血進(jìn)一步惡化，最終造成死亡率最高,成年羊抵抗力較強(qiáng),被感染羊有感染的情況。低濕的草地有利于本病的傳播的發(fā)病多在一月份，尤以一月份和三月多有發(fā)病。蟲(chóng)卵最適孵化溫度為 20~30℃，蟲(chóng)4℃停止發(fā)育，1℃以下低溫或 60℃以上高自由生活，抵抗力較弱，第 3 期幼蟲(chóng)因帶鞘

圖 1-2 RNAi 的發(fā)生機(jī)制Fig1-2 RNAi Mechanism篩選及合成基因水平上，必須需要一個(gè)有效的選擇過(guò)程來(lái)有高潛力的 siRNA 寡核苷酸。許多相互關(guān)聯(lián)體外的生物學(xué)活性[76]。就 RNA 靶位本身而言，點(diǎn)和蛋白質(zhì)的結(jié)合程度。核苷酸序列不僅影響通過(guò)非堿基配對(duì)相互結(jié)合作用與其他序列相關(guān)條 siRNA 寡聚核苷酸鏈作為高效抑制子的前雙鏈的形成。目前，設(shè)計(jì) siRNA 寡聚核苷酸域，如 5，和 3，非翻譯區(qū)域（UTR），75bp 的起小于 30%的序列。雖然已有的 siRNA 篩選規(guī)保證每一篩選的 siRNA 都起作用[77]。已知有

A B圖 2-1 熒光顯微鏡下觀察 siRNA 導(dǎo)入蟲(chóng)體情況Fig.2-1 Observation of siRNA introduction into worms under fluorescence microscope（A 白光下拍攝；B 熒光下拍攝）2.3.2 Q-PCR 檢測(cè)基因的表達(dá)抑制情況siRNA 干擾后收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)進(jìn)行 mRNA 抽提，反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，用 Q-PCR 檢測(cè) HAase 基因的表達(dá)情況，結(jié)果如圖 2-2 所示，電轉(zhuǎn)化 HC-HAase 基因特異性 siRNA 后能顯著降低 HC-HAase 基因的表達(dá)量，且抑制效果顯著（P＜0.05）。

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1 汪作民;李文志;宗澤君;梁春燕;夏國(guó)忠;;羊捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)、細(xì)

本文編號(hào)：2783390