【摘要】：本課題組在前期民豬冷應(yīng)激實(shí)驗(yàn)中篩選出ZBED6基因和Tβ4基因,二者表達(dá)均存在顯著差異,以與肌肉生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的ZBED6基因和與毛囊發(fā)育、毛發(fā)生長(zhǎng)顯著相關(guān)的Tβ4基因?yàn)槟康幕?分析啟動(dòng)子活性、篩選轉(zhuǎn)錄因子,以研究對(duì)民豬生長(zhǎng)性狀的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響。鋅指蛋白ZBED6(zinc finger bed domain containing 6,ZBED6)基因的突變,可促進(jìn)骨骼肌中胰島素樣生長(zhǎng)因子2(insulin-like growth factor 2,IGF2)轉(zhuǎn)錄水平的顯著上調(diào),從而促進(jìn)細(xì)胞增殖和肌管形成。ZBED6的過(guò)表達(dá)不僅可以抑制IGF2的轉(zhuǎn)錄,還能調(diào)控下游上千個(gè)與發(fā)育類疾病、癌癥和心血管疾病密切相關(guān)的重要基因。但關(guān)于該基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用機(jī)理目前尚不清楚,有待研究。胸腺素β4(thymosin beta4,Tβ4)基因是一個(gè)與毛囊發(fā)育和毛發(fā)生長(zhǎng)顯著相關(guān)的基因。利用胸腺素β4干預(yù)毛囊外毛根鞘細(xì)胞,其增殖效應(yīng)明顯,說(shuō)明胸腺素β4通過(guò)刺激毛囊外毛根鞘細(xì)胞增殖分化能夠促進(jìn)毛囊生長(zhǎng),然而具體作用機(jī)制尚不明確。本研究利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)ZBED6基因和Tβ4基因的5′端序列進(jìn)行克隆,通過(guò)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)兩種基因潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),構(gòu)建ZBED6基因和Tβ4基因5′端序列不同長(zhǎng)度缺失片段的報(bào)告基因熒光表達(dá)載體,利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)對(duì)兩種基因的啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行活性分析,利用缺失突變和過(guò)表達(dá)技術(shù)確定兩個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件,獲得主要研究結(jié)果如下:(1)以翻譯起始密碼子的“A”為+1,克隆得到豬ZBED6基因-2053~-21 bp序列,經(jīng)雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè),具有啟動(dòng)子活性。分段缺失后發(fā)現(xiàn)最小活性區(qū)域位于-1808~-1777 bp之間,存在正調(diào)控元件。(2)利用在線軟件預(yù)測(cè)ZBED6基因的-1808~-1777 bp區(qū)域內(nèi),存在CREMtaul、NKx2-5(var.2)、HINFP、Adf-1和CREB3五個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。突變掉Adf-1和CREB3的識(shí)別位點(diǎn)能夠極顯著降低ZBED6基因的啟動(dòng)子活性(P0.01)。但過(guò)表達(dá)CREB3元件,不能促進(jìn)ZBED6基因的表達(dá),說(shuō)明(-2041/-1565)-pGL3區(qū)域內(nèi)GACGT序列不是CREB3的結(jié)合位點(diǎn)。由于豬的Adf-1序列未知,暫只能確定ZBED6基因的最小活性區(qū)域在-1808~-1777 bp內(nèi)。(3)以翻譯起始密碼子的“A”為+1,克隆得到豬Tβ4基因-1218~+29 bp序列,經(jīng)雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè),具有啟動(dòng)子活性。分段缺失發(fā)現(xiàn)最小活性區(qū)域位于-155~-105 bp之間,存在正調(diào)控元件。(4)利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)Tβ4基因的-155~-105 bp區(qū)域內(nèi),存在ELK-1、MYBAS1和E2F-1三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。突變掉ELK-1識(shí)別位點(diǎn)能夠顯著降低Tβ4基因的啟動(dòng)子活性(P0.05)。過(guò)表達(dá)分析ELK-1轉(zhuǎn)錄元件可以促進(jìn)Tβ4基因的表達(dá),證明ELK-1是Tβ4基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵因子。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S828
【圖文】：

引 言1 引言1.1 啟動(dòng)子概述1.1.1 啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)真核生物基因表達(dá)調(diào)控的過(guò)程極為復(fù)雜，包括轉(zhuǎn)錄、加工、翻譯等，而轉(zhuǎn)錄是基因表達(dá)調(diào)控的起始過(guò)程，也是極為重要的一步[1]，生物體的生長(zhǎng)和發(fā)育受基因表達(dá)的調(diào)控，由于啟動(dòng)子是調(diào)控基因表達(dá)的重要元件，因此研究啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)與功能，對(duì)于從分子層面上更好地了解生物的生長(zhǎng)發(fā)育、疾病治療等都具有重要意義[2]。啟動(dòng)子是位于基因 5′端上游并能夠與 RNA 聚合酶特異性識(shí)別和結(jié)合的一段 DNA 序列，具有起始轉(zhuǎn)錄的功能，真核生物啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄原理比原核復(fù)雜，包含核心啟動(dòng)子元件和上游啟動(dòng)子兩種元件。

基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳鑒定

（-2053/-21）-ZBED6片段PCR擴(kuò)增

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 劉方;曹璐;牛昀;;Ets轉(zhuǎn)錄因子家族成員在乳腺癌中的作用研究進(jìn)展[J];中華病理學(xué)雜志;2017年12期

2 李彤;何永成;彭慶;張珊珊;蔣海露;;ApoAI/ABCA1途徑對(duì)糖尿病腎病大鼠的保護(hù)作用[J];深圳中西醫(yī)結(jié)合雜志;2015年17期

3 王長(zhǎng)青;肖強(qiáng);;轉(zhuǎn)錄因子E2F-1的研究進(jìn)展[J];中華腫瘤防治雜志;2011年04期

4 李曉波;張俊武;;真核生物中鋅指蛋白的結(jié)構(gòu)與功能[J];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2009年03期

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1 孫亞蒙;民豬FST基因的克隆及其在冷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程中的功能初探[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

2 宋佳樂(lè);胸腺素β4優(yōu)化內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究[D];浙江大學(xué);2015年

3 黃永震;黃牛肌肉生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因甲基化鑒定及IGF2和ZBED6基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2014年

4 徐劍文;擬南芥鋅指蛋白基因AtSRZ5的功能研究和鹽脅迫下水稻葉片蛋白質(zhì)組學(xué)分析[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

5 林琳;microRNA與人乳頭瘤病毒16型的作用靶點(diǎn)研究[D];復(fù)旦大學(xué);2013年

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1 黨云龍;遼寧絨山羊IGF2和ZBED6基因分子特征、表達(dá)及甲基化研究[D];沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

2 王鑫鑫;民豬FoxN1基因啟動(dòng)子核心區(qū)的鑒定及對(duì)冷應(yīng)激的應(yīng)答研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

3 馬燕;綿羊ZBED6基因的遺傳變異及其與胴體性狀的相關(guān)性研究[D];石河子大學(xué);2016年

4 徐倩倩;玉米CCCH型鋅指蛋白基因ZmC3H54的抗逆功能分析[D];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

5 桓蕾;阿爾巴斯白絨山羊胸腺素β4毛囊發(fā)育相關(guān)信號(hào)通路的研究[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2015年

6 張孝峰;新的候選肝癌標(biāo)志物胸腺肽β4的初步驗(yàn)證及其影響肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2013年

7 祁艷梅;豬CREB家族基因的克隆及表達(dá)研究的初步探討[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

本文編號(hào)：2781411