【摘要】：H9亞型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)對雞的致病性低,僅引起輕微的呼吸道癥狀和短時間產(chǎn)蛋下降,但混合感染或繼發(fā)感染其他病原可導致較高的發(fā)病率和死亡率。H9亞型禽流感對養(yǎng)雞業(yè)危害較大,免疫接種是防控該病的主要策略之一。目前生產(chǎn)上常用的H9亞型禽流感疫苗為全病毒滅活疫苗,這類疫苗僅能誘導產(chǎn)生高水平的循環(huán)抗體,而不能有效地激發(fā)細胞免疫和黏膜免疫應答。近年來,以火雞皰疹病毒(herpesvirus of turkey,HVT)為載體的重組病毒活疫苗已經(jīng)成為研究熱點。一方面,HVT具有較多的復制非必需區(qū)可供外源基因插入;另一方面HVT是常用的家禽疫苗,可供1日齡雛雞免疫或18日齡胚內(nèi)注射免疫,能夠更早地誘導免疫應答。本研究旨在以HVT為載體,構(gòu)建能穩(wěn)定表達H9亞型AIV血凝素(HA)的重組病毒活疫苗候選毒株,與現(xiàn)有滅活疫苗組合使用,以提供更加有效的免疫保護。1.rHVT-YBF003株的構(gòu)建及其遺傳穩(wěn)定性與安全性評價重組病毒構(gòu)建:對近年分離的21株H9亞型AIV進行HA基因測序和遺傳進化分析,發(fā)現(xiàn)這些毒株處于h9.4.2.5分支,為目前H9亞型AIV的優(yōu)勢流行毒株。因此,本研究選取其中的YBF003株,用于重組病毒的構(gòu)建。采用RT-PCR擴增H9亞型AIV YBF003株的HA基因,將HA基因插入到含HVT FC-126疫苗株同源臂和CMV啟動子的載體,構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pFR-H9。將pFR-H9與表達綠色熒光蛋白(EGFP)的重組HVT(rHVT-EGFP)基因組共轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細胞(CEF),以同源重組的方式將rHVT-EGFP的EGFP基因替換為HA基因表達盒,獲得重組病毒rHVT-YBF003株。在CEF單層上反復純化rHVT-YBF003株,直至所有重組病毒空斑均不帶綠色熒光。經(jīng)PCR鑒定,HA基因表達盒正確插入到HVT基因組;進一步進行Western-blot和IFA鑒定,rHVT-YBF003株能夠表達HA蛋白。分別用rHVT-YBF003株和HVTFC-126株感染CEF,兩者的生長特性并無顯著差異。將rHVT-YBF003株在CEF上連續(xù)傳20代,再接種于CEF單層,待形成典型空斑后,通過PCR從隨機挑選的20個空斑中均能檢測到HA基因表達盒;將第20代rHVT-YBF003株接種于CEF單層,通過間接免疫熒光試驗(IFA)證明rHVT-YBF003株能夠穩(wěn)定表達H9亞型AIV的HA蛋白。重組病毒的遺傳穩(wěn)定性:1日齡SPF雞頸部皮下接種rHVT-YBF003株,5.0×103 PFU/只;21日齡時,從血液中分離淋巴細胞,再接種于另一批次1日齡SPF雞(3.0×106個淋巴細胞/羽份)。如此反復傳代6次,經(jīng)PCR檢測傳代后的rHVT-YBF003株中均存在HA基因,IFA證明傳代后的重組病毒仍能穩(wěn)定表達H9亞型AIV的HA蛋白。1日齡SPF雞頸部皮下接種rHVT-YBF003株,5.0×103PFU/羽份;每隔7天采血分離淋巴細胞,再接種于CEF單層,進行病毒分離和計數(shù)。結(jié)果顯示,rHVT-YBF003株在雞體內(nèi)的病毒載量不斷提高,至9周齡時,病毒載量達到峰值,此后呈下降趨勢,直到第20周齡時仍能檢測到少量重組病毒存在,說明該重組病毒可在雞體內(nèi)維持較長時間。重組病毒的安全性:以5.0X 104PFU/羽份的rHVT-YBF003株接種1日齡SPF雞,對雞群進行連續(xù)8周的臨床觀察、生長狀況監(jiān)測,結(jié)果顯示接種重組病毒的試驗雞精神、采食、飲水均正常,剖檢和組織切片檢查均未發(fā)現(xiàn)病理變化。以5.0×104PFU/頭份的rHVT-YBF003株接種4周齡ICR小鼠,接種后ICR小鼠的采食、精神均正常;接種后14天,對小鼠內(nèi)臟器官檢查并稱重,顯示接種重組病毒對小鼠無不良影響。因此,重組病毒對易感動物和非易感動物均具有良好的安全性。2.rHVT-YBF003株的免疫效力評價對SPF雞的免疫保護效力試驗:試驗分為4組,分別為胚內(nèi)免疫組、1日齡免疫組、滅活疫苗組和空白對照組;分別對18日齡SPF雞胚胚內(nèi)注射5.0X 103PFU/羽份的rHVT-YBF003株、1日齡SPF雛雞皮下注射5.0X 103PFU/羽份的rHVT-YBF003株、14日齡SPF雛雞肌肉注射H9亞型禽流感病毒滅活疫苗(YBF003株)、1日齡SPF雛雞皮下注射0.5 mLPBS/只。28日齡時,采血測定各試驗組針對H9亞型AIV的HI抗體效價,并以H9亞型AIV YBF003株攻毒(靜脈注射1.0X 1 07 5 EID50/羽份)。28日齡時,胚內(nèi)免疫組和1日齡免疫組的HI抗體效價分別為4.7±0.60和4.5±0.30,胚內(nèi)免疫組比1日齡免疫組的HI抗體最大提高0.3±0.62個滴度,兩組均能提供一定的早期保護;滅活疫苗組的HI抗體效價為6.5±0.75,攻毒保護率為50%;空白對照組的抗體為1.3±0.12,攻毒保護率為0%。對商品雞的免疫保護效力試驗:對商品雞的分組及處理方式同SPF雞。另外,增加重組病毒與滅活疫苗聯(lián)合免疫組,該組于1日齡時頸部皮下注射5.0×103PFU/羽份的rHVT-YBF003株,14日齡時經(jīng)肌肉注射H9亞型禽流感病毒滅活疫苗(YBF003株)。28日齡時,采血測定各試驗組針對H9亞型AIV的HI抗體效價,并以H9亞型AIV YBF003株攻毒(靜脈注射1.0×107.5EID50/羽份)。28日齡時,胚內(nèi)免疫組、1日齡免疫組和滅活疫苗免疫組的HI抗體效價分別為4.3±0.49、4.1 ±0.89和6.2±0.34,攻毒保護率均為50%以上,差異不顯著;而聯(lián)合免疫組的抗體效價為7.8±0.45,攻毒保護率為70%;空白對照組的抗體為1.0±0.74,攻毒保護率為10%。3.重組病毒種子批建立與大規(guī)模培養(yǎng)工藝研究培養(yǎng)工藝研究:為提高重組病毒的效價,同時獲得規(guī)�；a(chǎn)條件下的重組病毒培養(yǎng)技術(shù)參數(shù)。我們對采用細胞工廠進行大規(guī)模培養(yǎng)的方法進行了研究。結(jié)合該病毒的培養(yǎng)特性,分別從宿主細胞的接種密度、種毒接種劑量和收毒時間等方面對培養(yǎng)工藝進行摸索,最終制定了最優(yōu)的病毒培養(yǎng)技術(shù)工藝:即采用十層細胞工廠(總面積為6335 cm2,培養(yǎng)液為1200mL),CEF密度為2.5×106個/mL時,接種3.0×106PFU的重組病毒,培養(yǎng)72 h,收獲感染細胞,按照每個細胞工廠分裝50支凍存管的標準進行收獲,每支凍存管分裝量為1.8mL,其收獲的病毒效價可達5.0×106PFU/支以上,即成品疫苗可達5000 PFU/羽份以上,遠高于2000 PFU/羽份的國家標準。種子批建立:將所收獲的重組病毒分為原始種子、基礎種子和生產(chǎn)種子。原始種子包括重組病毒的F1～F6代,基礎種子包括F7～F12代,生產(chǎn)種子包括F13～F17代。并在各級種子批中隨機選取一個代次的種子進行無菌檢驗、支原體檢驗、鑒別檢驗、安全性檢驗、免疫原性檢驗和外源病毒檢驗。無菌檢驗和支原體檢驗中,三個代次種毒的檢驗結(jié)果均為陰性;鑒別檢驗中,對HVT鑒定部分采用間接免疫熒光試驗,結(jié)果顯示,三個代次種毒形成的病毒空斑均呈現(xiàn)綠色熒光,說明形成的病毒空斑為HVT,對HVT表達的HA蛋白鑒定采用Western-blot方法鑒定,結(jié)果顯示,三個代次種毒均能表達HA蛋白;安全性檢驗中,三個代次的種毒接種1日齡SPF雞,免疫劑量為3.0×104PFU/羽,免疫后觀察90天,所有免疫雞均未觀察到臨床癥狀;外源病毒檢驗中,分別于1日齡和21日齡時,采用滴鼻、點眼(劑量為3.0×104PFU/羽份)和肌肉注射(劑量為3.0×104PFU/羽份)三種途徑同時接種重組病毒,42日齡時采集血清,均未檢測到外源病毒的抗體。結(jié)果顯示,三個代次的重組病毒均符合種毒質(zhì)量標準。綜上所述,本研究構(gòu)建了一株表達H9亞型AIV HA蛋白的重組HVT(rHVT-YBF003株)。在體內(nèi)和體外傳代過程中,rHVT-YBF003株所插入的HA基因均能穩(wěn)定表達。在安全性評價方面,該重組病毒對易感和非易感動物均不具有致病性。該重組病毒可用于1日齡雛雞和18日齡雞胚內(nèi)的早期免疫,雖然HI抗體低于滅活疫苗,但對H9亞型AIV的保護率等同于滅活疫苗。重組病毒與滅活疫苗聯(lián)合使用具有協(xié)同效應,對H9防控效果更好。本研究還建立了種子批,并制定了符合大規(guī)模生產(chǎn)的重組病毒培養(yǎng)工藝,為將來工廠化生產(chǎn)打下了基礎。
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S852.65
【圖文】：

括囊膜纖突蛋白血凝素（ＨＡ）和神經(jīng)氨酸酶（ＮＡ），以及核蛋白（ＮＰ）、三個聚合酶逡逑蛋白（ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２）、兩個基質(zhì)蛋白（Ｍｌ、Ｍ２）和兩個非結(jié)構(gòu)蛋白（ＮＳ１、ＮＳ２），逡逑如圖１．１所示［５＿７］。逡逑１．１邋ＨＡ基因的結(jié)構(gòu)和功能逡逑血凝素蛋白（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ，邋ＨＡ）以三聚體呈棒狀結(jié)構(gòu)，屬于Ｉ型跨膜蛋白，其竣基逡逑端鑲嵌于病毒囊膜中，親水的氨基端則突出于病毒粒子表面，是流感病毒囊膜纖突的主逡逑要成分之一［８］。ＨＡ蛋白作為囊膜表面的糖蛋白，位于流感病毒識別宿主細胞表面受體的逡逑功能區(qū)域，在病毒的感染和復制過程中發(fā)揮著重要的作用。逡逑

ＭＤＶ具有較大基因組結(jié)構(gòu)，由一個長獨特區(qū)（ＵＬ），邋—個短獨特區(qū)（ＵＳ），逡逑以及獨特區(qū)兩側(cè)的相同插入重復片段，長重復序列（ＴＲＬ）邋／內(nèi)部重復序列（ＩＲＬ），連同逡逑短重復序列（ＴＲＳ）邋／內(nèi)部短重復序列（ＩＲＳ）構(gòu)成（如圖３．１所示）。在病毒基因組的短逡逑獨特區(qū)（ＵＳ）為病毒生長的非必需區(qū)，在這些復制非必需區(qū)中插入大片段的外源基因不會逡逑影響病毒的復制，因此可選用ＭＤＶ作為活病毒載體通過構(gòu)建的轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒與馬逡逑立克氏病病毒基因組共轉(zhuǎn)染的方法構(gòu)建重組病毒。在屬于皰疹病毒復制非必X目寺″義掀沃脅迦胨澩锏耐庠椿蚣捌溆泄氐骺卦�，使外源基因的林v嚶滌杏肭妝靜《懼義賢吹男蛄小Ｍü粗刈櫚姆絞劍雇庠椿蠆迦氳講《局�，经包装芯晞x《究帕！ｅ義嫌檬實鋇姆椒ń浞擲氪炕�，磦蝤得祪e鼙澩锿庠椿虻鬧刈椴《盡ｅ義希擼危危桑懾澹卞危卞巍義希裕遙體澹眨體澹桑遙體澹桑遙渝澹眨渝澹裕遙渝義賢跡常別逭畈《凈蜃橄咝越峁雇跡ㄕ裕豪釹啵砹⒖聳襄義喜《痙腫由镅а衃偨梗邸觶。藎澹玻埃保擔澹保玻ǎ常叮哄澹擔福擔梗╁義希疲椋玨澹常卞澹蹋椋睿澹幔蟈澹螅簦潁酰悖簦酰潁邋澹錚駑澹瑁澹潁穡澹簀澹觶椋潁酰簀澹紓澹睿錚恚邋義希停模腫魑畈《駒靨寰哂幸韻碌撓諾�，一、ＭＤＶ为细胞结洪e圓《荊咼緱庖咤義系募芍丈

本文編號：2780420