【摘要】：瘧原蟲(chóng)是一種寄生在紅細(xì)胞內(nèi)的胞內(nèi)寄生蟲(chóng),其生長(zhǎng)繁殖主要都在紅細(xì)胞內(nèi)完成。由于紅細(xì)胞內(nèi)缺少維持正常生命活動(dòng)所需要的細(xì)胞器,所以在受到氧化壓力時(shí),寄生在紅細(xì)胞內(nèi)的瘧原蟲(chóng)DNA更容易受到氧化損傷,受到損傷的瘧原蟲(chóng)是怎樣進(jìn)行自我修復(fù)的,其修復(fù)機(jī)制又是什么?這對(duì)瘧原蟲(chóng)的相關(guān)免疫逃避機(jī)制、以及新型藥物與疫苗的研制具有重要的意義。在本實(shí)驗(yàn)中,我們通過(guò)生物信息學(xué)分析篩選得到了瘧原蟲(chóng)Tat D-like DNase蛋白質(zhì),該蛋白質(zhì)具有保守的Tat D DNase結(jié)構(gòu)域,是具有金屬離子依賴性的脫氧核糖核酸酶,其蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與生物學(xué)特性同大腸桿菌Tat D蛋白質(zhì)類似,且大腸桿菌Tat D蛋白質(zhì)已經(jīng)被證實(shí)參與到大腸桿菌DNA的氧化損傷修復(fù)過(guò)程當(dāng)中。所以本課題試圖揭示,在瘧原蟲(chóng)中Tat D-like DNase是否具有與大腸桿菌的Tat D類似的修復(fù)DNA損傷的功能,并以此為基礎(chǔ)對(duì)其作為疫苗候選抗原的免疫原性進(jìn)行相關(guān)研究。首先,我們利用PCR技術(shù)對(duì)不同流行地區(qū)的惡性瘧原蟲(chóng)Tat D-like DNase基因進(jìn)行擴(kuò)增對(duì)其保守性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,各流行地區(qū)的惡性瘧原蟲(chóng)野生株編碼Tat D-like DNase的m RNA序列完全相同;差異均發(fā)生在內(nèi)含子區(qū)且僅存在5%的差異。由此可知,惡性瘧原蟲(chóng)Tat D-like DNase基因在各流行地區(qū)都十分保守,這為以該蛋白質(zhì)作為藥物候選靶標(biāo)與疫苗候選抗原奠定了基礎(chǔ)。其次,利用間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)對(duì)Tat D-like DNase在蟲(chóng)體內(nèi)的分布情況進(jìn)行定位。結(jié)果顯示,在惡性瘧原蟲(chóng)配子體時(shí)期、伯氏瘧原蟲(chóng)有性與無(wú)性階段該蛋白質(zhì)均有表達(dá),且分布為于蟲(chóng)體的細(xì)胞膜附近。Tat D-like DNase蛋白質(zhì)在瘧原蟲(chóng)各個(gè)發(fā)育階段均有表達(dá)的特性,為Tat D-like DNase作為瘧原蟲(chóng)傳播阻斷疫苗的候選抗原提供了理論依據(jù)。最后,我們通過(guò)單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)與蛋白質(zhì)遷移試驗(yàn),證明了該蛋白質(zhì)在氧化壓力存在的情況下,基因的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào),蛋白質(zhì)遷移到細(xì)胞核位置參與到修復(fù)DNA損傷的過(guò)程。通過(guò)對(duì)伯氏瘧原蟲(chóng)野生株與Tat D-like DNase敲除株進(jìn)行比較研究發(fā)現(xiàn),Tat D-like DNase缺陷株的蟲(chóng)體毒力、感染能力與致死性顯著下降,并且在蟲(chóng)體受到氧化壓力時(shí)Tat D-like DNase缺陷株DNA損傷情況較野生株嚴(yán)重。由此證明了在瘧原蟲(chóng)中,Tat D-like DNase參與了DNA氧化后損傷修復(fù)的過(guò)程。在免疫保護(hù)性方面,我們證明了Tat D-like DNase抗體可以有效地抑制伯氏瘧原蟲(chóng)在小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)發(fā)育及配子體的出絲率;有效降低合子在蚊體內(nèi)的形成數(shù)量;我們采用不同佐劑與Tat D-like DNase蛋白質(zhì)混合免疫小鼠,發(fā)現(xiàn)Montanide ISA51佐劑具有良好的保護(hù)效果與免疫原性。以上結(jié)果顯示,瘧原蟲(chóng)Tat D-like DNase蛋白質(zhì)具有修復(fù)蟲(chóng)體DNA損傷的功能,且能有效地抑制蟲(chóng)體有性時(shí)期與無(wú)性時(shí)期的發(fā)育,該蛋白質(zhì)具有作為瘧疾紅內(nèi)期疫苗與傳播阻斷疫苗候選抗原的潛質(zhì)。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.72
【圖文】：

圖 1.1 PfTatD-like DNase 的結(jié)構(gòu)域分析Figure 1.1 Structure analysis of PfTatD-like DNas結(jié)構(gòu)分析，由圖 1.2 可以看出，PfTatD-like DNaaa（1-23 aa）的信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，根據(jù)信號(hào)肽假說(shuō)我們質(zhì)網(wǎng)加工分泌途徑進(jìn)行加工，并在轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中穿過(guò)。然后我們通過(guò) swiss model 對(duì)該蛋白進(jìn)行建模，行預(yù)測(cè)。由圖 1.3 可以看出該蛋白質(zhì)由 6 個(gè) α 螺旋包裹在其內(nèi)部。由于其末端 α 螺旋為發(fā)揮脫氧核糖被包裹在其結(jié)構(gòu)內(nèi)部，并利用其活性中心對(duì)其進(jìn)行

圖 1.3 PfTatD-like DNase 3D 模型構(gòu)建ure 1.3 PfTatD-like DNase 3D model constru圖中藍(lán)色片段為 α 螺旋，綠色片段為 β 折疊rts is αhelices and purple parts is β-pleated sheets in 分析 軟件，將PfTatD-likeDNase 與不同種屬瘧原蟲(chóng) 進(jìn)化樹(shù)。如圖 1.4，PfTatD-like DNase（PF3D7原蟲(chóng)的TatDDNase親緣關(guān)系較近；與DNaseI遠(yuǎn)。

圖 1.3 PfTatD-like DNase 3D 模型構(gòu)建Figure 1.3 PfTatD-like DNase 3D model construction圖中藍(lán)色片段為 α 螺旋，綠色片段為 β 折疊In figure the green parts is αhelices and purple parts is β-pleated sheets in the secondary structure1.3.2 生物進(jìn)化樹(shù)分析利用 Mega6.0 軟件，將PfTatD-likeDNase 與不同種屬瘧原蟲(chóng)的DNase 共同構(gòu)建minimum-evolution 進(jìn)化樹(shù)。如圖 1.4，PfTatD-like DNase（PF3D7_0112000）（紅色方框）與其他種屬瘧原蟲(chóng)的TatDDNase親緣關(guān)系較近；與DNaseI 和DNaseIII 在進(jìn)化關(guān)系上親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

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本文編號(hào)：2780108