【摘要】：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是來(lái)源于中胚層的成體干細(xì)胞之一,能夠分化為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成脂肪細(xì)胞等細(xì)胞類(lèi)型,因此,其常作為組織再生的重要的細(xì)胞來(lái)源之一。然而,目前對(duì)BMSCs定向分化分子機(jī)制的研究仍然存在疑問(wèn),不清楚有哪些因素影響了其分化潛能。最近的研究發(fā)現(xiàn),Homeobox(HOX)基因參與了BMSCs的增殖、凋亡和分化的調(diào)節(jié)過(guò)程。本研究通過(guò)分離綿羊BMSCs(sBMSCs)、構(gòu)建HOXC10的過(guò)表達(dá)載體及干擾載體,將兩種載體利用電轉(zhuǎn)染的方法分別轉(zhuǎn)入sBMSCs中,觀(guān)察HOXC10對(duì)sBMSCs增殖、凋亡的影響。在此基礎(chǔ)上分別對(duì)sBMSCs進(jìn)行成脂誘導(dǎo)及成骨誘導(dǎo),通過(guò)油紅O染色、脂滴定量檢測(cè)、茜素紅染色、骨鈣素定量分析,以及對(duì)成脂、成骨相關(guān)基因在mRNA及蛋白水平的表達(dá)情況檢測(cè),研究HOXC10在sBMSCs成脂及成骨分化過(guò)程中的功能及其對(duì)分化潛能的影響。利用細(xì)胞貼壁法分離sBMSCs,通過(guò)傳代、免疫熒光觀(guān)察以及細(xì)胞誘導(dǎo)檢測(cè)其干細(xì)胞特性,結(jié)果表明已成功分離sBMSCs。同時(shí),通過(guò)基因片段PCR、連接、酶切等方法成功構(gòu)建了HOXC10的過(guò)表達(dá)載體及干擾載體。220V、2.5ms條件下對(duì)sBMSCs進(jìn)行電轉(zhuǎn)染,在電轉(zhuǎn)染48h后進(jìn)行效率檢測(cè),發(fā)現(xiàn)HOXC10過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)入sBMSCs后HOXC10表達(dá)量較于對(duì)照組升高371.68倍,而轉(zhuǎn)染干擾載體的sBMSCs中HOXC10表達(dá)量相較于對(duì)照組降低了80.38%,表明構(gòu)建的兩個(gè)載體為有效載體。電轉(zhuǎn)染后的sBMSCs培養(yǎng)24h、48h、72h后分別加入CCK8(Cell Counting Kit-8),并于450nm處檢測(cè)吸光度值,發(fā)現(xiàn)HOXC10的過(guò)表達(dá)會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng),HOXC10的干擾會(huì)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)HOXC10對(duì)于sBMSCs凋亡情況的影響發(fā)現(xiàn):HOXC10過(guò)表達(dá)會(huì)抑制sBMSCs凋亡,而干擾HOXC10則能促進(jìn)sBMSCs凋亡。分別將轉(zhuǎn)入HOXC10過(guò)表達(dá)和干擾載體的sBMSCs在成脂誘導(dǎo)3d、6d、12d、18d后通過(guò)油紅O染色、脂滴定量檢測(cè)、觀(guān)察其脂滴形成情況,同時(shí)利用qPCR、Western Blot及灰度分析對(duì)成脂誘導(dǎo)相關(guān)基因LPL、PPARG、Fabp4、ACC的mRNA轉(zhuǎn)錄水平及LPL、PPARG的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)HOXC10過(guò)表達(dá)對(duì)于成脂誘導(dǎo)具有促進(jìn)作用,干擾HOXC10能抑制成脂過(guò)程。同時(shí),分別將轉(zhuǎn)入HOXC10過(guò)表達(dá)和干擾載體的sBMSCs在成骨誘導(dǎo)3d、7d、11d、14d通過(guò)茜素紅染色、鈣結(jié)節(jié)定量檢測(cè)觀(guān)察其鈣結(jié)節(jié)形成情況,并通過(guò)qPCR、Western Blot以及灰度分析檢測(cè)成骨誘導(dǎo)相關(guān)基因COLIA1、BMP5、Runx2、OPN的mRNA轉(zhuǎn)錄水平及Runx2、OPN的蛋白表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)HOXC10基因過(guò)表達(dá)及干擾對(duì)于sBMSCs成骨沒(méi)有明顯的作用。本研究結(jié)果表明,HOXC10過(guò)表達(dá)對(duì)sBMSCs的增殖起促進(jìn)作用、對(duì)其凋亡起抑制作用,同時(shí)能促進(jìn)成脂。反之,HOXC10干擾則能抑制sBMSCs增殖,促進(jìn)其凋亡、對(duì)成脂起抑制作用。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)HOXC10表達(dá)量的變化對(duì)sBMSCs成骨沒(méi)有明顯的作用。以上實(shí)驗(yàn)研究為今后深入研究HOXC10在BMSCs分化過(guò)程中的功能及其對(duì)分化潛能的作用機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S826
【圖文】：

圖 1.1 HOX 基因簇進(jìn)化情況[10]Figure 1.1 Genesis and evolution of HOX clusters物的同源盒基因共分為兩類(lèi)：一類(lèi)為成簇排列在染進(jìn)行表達(dá)的 I 類(lèi)同源盒基因（A-P 型），也被稱(chēng)為 特異性；另一類(lèi)是與 HOX 基因有高度的序列同一性為散在 Homeobox 基因，研究人員普遍認(rèn)為這些基多數(shù)的基因獨(dú)立散布在不同染色體上。這些散在 H能，還執(zhí)行其它功能，其中部分散在 Homeobox 基普遍認(rèn)為這類(lèi) ParaHOX 基因本質(zhì)上是 HOX 基因在集群。另外，HOX 基因還存在一種親緣關(guān)系更加疏稱(chēng)為 NK 簇。比較基因組學(xué)研究表明 NK 簇、HOX 和且具有進(jìn)化相關(guān)性，但三者在胚胎發(fā)育過(guò)程中的表

圖 3.1 原代 sBMSCs 形態(tài)（4×）A：第 6 天 sBMSCs 形態(tài) B：第 9 天 sBMSCs 形態(tài)Figure 3.1 Morphology of primary sBMSCs (4×)A: Morphology of 6d sBMSCs B: Morphology of 9d sBMSCs 代 sBMSCs 的復(fù)蘇后形態(tài) 3.2 分別為 sBMSCs P2 細(xì)胞解凍 4h、24h、48h、72h 的細(xì)胞形態(tài)。從圖上可以 sBMSCs 在解凍 4h 后已經(jīng)完成貼壁，細(xì)胞形態(tài)多趨近于圓形。解凍 24h 后可，多為長(zhǎng)梭形或長(zhǎng)多邊形，這是典型的 BMSCs 細(xì)胞形態(tài)。細(xì)胞數(shù)隨培養(yǎng)時(shí)間，由于細(xì)胞間接觸越來(lái)越緊密，細(xì)胞形態(tài)接近于短梭形，在 72h 細(xì)胞匯合度已接傳代或下一步實(shí)驗(yàn)操作。

圖 3.2 P2 sBMSCs 的復(fù)蘇后形態(tài)（4×）A：復(fù)蘇 4h 后 sBMSCs 形態(tài) B：復(fù)蘇 24h 后 sBMSCs 形態(tài)C：復(fù)蘇 48h 后 sBMSCs 形態(tài) D：復(fù)蘇 72h 后 sBMSCs 形態(tài)igure 3.2 Morphology of post-recovery P2 generation sBMSCs（4×）logy of sBMSCs after 4h recovery B: Morphology of sBMSCs after 24h rlogy of sBMSCs after 48h recovery D: Morphology of sBMSCs after 72h r熒光鑒定

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本文編號(hào)：2778140