【摘要】：近年來,牛呼吸系統(tǒng)疾病(bovine respiratory disease,BRD)給我國的肉牛養(yǎng)殖業(yè)造成了較嚴重的經(jīng)濟損失,導(dǎo)致誘發(fā)BRD的主要病原菌牛支原體(Mycoplasma bovis,M.bovis)、牛莢膜血清A型多殺性巴氏桿菌(Pasteurella mutocida,Pm)和牛溶血曼氏桿菌(Mannheimia haemolytica,Mh)由于其耐藥性不斷增強,給該病的預(yù)防和控制造成了嚴重的困擾。因此尋找新型治療方法,優(yōu)化治療策略已迫在眉睫。本研究通過傳統(tǒng)分離法對采自延吉、吉林等地的酸奶、泡菜樣品中的乳酸菌進行分離鑒定,并以Pm、Mh、M.bovis為指示菌,初步篩選具有拮抗作用的乳酸菌。本實驗從樣品中共分離得到115株乳酸菌,并以致病菌Pm、Mh、M.bovis為指示菌進行初篩后得到5株具有較好抑菌效果的乳酸菌,分別編號為P5(鼠李糖乳桿菌,Lactobacillus rhamnosus)、P1(植物乳桿菌,Lactobacillus plantarum)、24-1(嗜酸乳桿菌,Lactobacillus acidophilus)、8-1(屎腸球菌,Enterococcus faecium)、Z1(鼠李糖乳桿菌,Lactobacillus rhamnosus)。本研究還對5株乳酸菌的生理特性、溶血活性和耐藥性等進行了檢測。并對其發(fā)酵上清液進行抑菌活性的研究。試驗結(jié)果表明,復(fù)篩出菌株P(guān)5抑菌活性最強,生長速度較快,對絕大多數(shù)抗生素敏感,無溶血活性,熱穩(wěn)定性好。選取P5株評價其對小鼠BRD肺炎模型的保護作用。結(jié)果表明,P5對由Pm和Mh誘發(fā)的BRD肺炎小鼠起到明顯的預(yù)防保護作用。研究結(jié)果為BRD新型預(yù)防策略的制定提供了理論指導(dǎo)和實驗依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S858.23
【圖文】：

圖 1.1 乳酸菌 16S rDNA 電泳圖M:DL2000 DNAMarker；1-12 菌株編號：8-1、P1、24-1、P5、Z1、37-3、38-5、41-2、Z2、16-2、9-1、13-1Fig.1.1 electrophoresis of lactobacillus 16S rDNAM: DL2000 DNAMarker;Strains 1-12 were numbered : 8-1， P1， 24-1， P5， Z1、37-3， 38-5， 41-2， Z2， 16-2， 9-1， 13-1表 1-6 序列同源性比對結(jié)果Tab.1-6 homology alignment results of sequences菌株編號 鑒定結(jié)果 同源性 菌株編號 鑒定結(jié)果 同源性9-1 L. plantarum 99% P6 L. plantarum 99%19-3 L. plantarum 98% 8-3 L. plantarum 99%6-1 L. plantarum 99% P2 L. plantarum 99%31-3 L. plantarum 99% P3 L. plantarum 99%30-2 L. plantarum 99% P4 L. plantarum 99%7-1 L. plantarum 99% E1 L. plantarum 99%

1.3.2 具有拮抗作用乳酸菌的篩選采用牛津杯法和牛支原體顏色變化單位來測定乳酸菌上清液對 BRD 主要病原菌的生長抑制作用，從 115 株乳酸菌中篩選出 12 株具有拮抗 BRD 主要病原菌功能的乳酸菌如表 1-7 和 1-8。菌株種類為兩株植物乳桿菌 P1、41-2，一株短乳桿菌 16-2，一株嗜酸乳桿菌 24-1，三株鼠李糖乳桿菌 P5、Z2、Z1，一株干酪乳桿菌 9-1，一株清酒乳桿菌 38-5，兩株屎腸球菌 41-2、8-1，一株嗜熱鏈球菌 13-1。其中 P1、P5、24-1、8-1、Z1 抑菌效果較好，菌株抑菌圈效果如圖 1.2 所示。因此選擇這五株菌進行后續(xù)研究。

組為只加 200μl 蒸餾水的空白組，方法按照 1.2.3.3 操作。上清液與病原菌共培養(yǎng)生長的測定后的 Pm 和 Mh 接種于液體 BHI，調(diào)菌濃度為 106CFU/mL 并加入 10%上清液，37℃培養(yǎng)。在培養(yǎng)后的 0h，24h，48h 分別取樣，梯度稀釋后，37℃培養(yǎng) 24h 后進行菌落計數(shù)。M.bovis 接種于液體 PPLO，調(diào)濃L，并加入 10%培養(yǎng) 48h 的乳酸菌上清液，37℃培養(yǎng)，在培養(yǎng)后的 0h，2樣測菌液濃度。生理特性的研究生長曲線的測定乳酸菌生長曲線如圖 2.1。它們在培養(yǎng) 12h 左右進入對數(shù)生長期，P5 和入穩(wěn)定期，24-1 在培養(yǎng) 30h 后進入穩(wěn)定期，Z1 和 8-1 在培養(yǎng) 35h 后進 P1 生長速度比其他三株快，但是穩(wěn)定期最大菌體數(shù)量同 8-1、Z1 相比較

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3 張t

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