【摘要】：偽狂犬病是由偽狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的多動物共患病,豬是偽狂犬病毒的天然宿主。2011年底,我國多省份經(jīng)gE基因缺失株Bartha-K61弱毒疫苗免疫的豬突發(fā)偽狂犬疫病,對豬場造成巨大經(jīng)濟損失。病毒分離等實驗證明疫病爆發(fā)根源是該毒株發(fā)生變異。對感染PRV變異株和疫苗免疫的豬區(qū)別診斷,是國際上控制偽狂犬病的策略之一。為有效防控并清除豬偽狂犬病,亟需建立針對PRV變異株gE蛋白抗體的檢測方法。本實驗用原核系統(tǒng)表達了PRV新流行株河南博愛株的gE蛋白,建立了一系列檢測gE蛋白抗體的方法。建立了間接ELISA方法,包被抗原濃度0.32μg/mL,待檢血清1:400稀釋,1%牛血清白蛋白(BSA)封閉,羊抗豬IgG 5 000倍稀釋,以5倍信噪比為陰陽性判定標準。本方法與阻斷法ELISA試劑盒相比符合率為91.36%,靈敏性為76.92%,特異性為94.12%。為建立更快速的檢測方法,基于間接ELISA實驗,我們將gE蛋白與豬IgG分別作為檢測線和質(zhì)控線,以膠體金顆粒標記羊抗豬IgG制備免疫膠體金,組裝成膠體金免疫層析試紙條。試紙條的質(zhì)控線(C線)包被2 mg/mL的豬IgG,檢測線(T線)包被2 mg/mL的gE蛋白。膠體金標羊抗豬IgG的pH 9.0~9.2,濃度0.07 mg/mL。敏感性實驗發(fā)現(xiàn),血清稀釋640倍時檢測線和質(zhì)控線最清晰,但特異性實驗發(fā)現(xiàn)試紙條特異性較差。為更快速準確地檢測gE蛋白抗體,我們建立了基于磁珠的檢測方法。優(yōu)化反應條件后,本方法檢測限達到陽性血清稀釋51 200倍,線性范圍為血清稀釋50~25 600倍,靈敏度比ELISA方法有較大提高。并且,本方法可在30 min內(nèi)完成gE蛋白抗體檢測。綜上所述,本實驗建立了三種檢測PRV gE蛋白抗體的方法:間接ELISA方法、免疫層析試紙條方法以及基于磁珠的快速檢測方法�；诖胖榈目焖贆z測具有靈敏度高、操作簡便等優(yōu)點,有望開發(fā)成新型PRV gE蛋白抗體快速檢測商品化試劑盒。
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S852.4
【圖文】：

圖 1-1 豬偽狂犬病毒粒子(Pomeranz et al 2005)Fig.1-1 The PRV virion偽狂犬病流行病學980s 以后豬偽狂犬病在世界范圍內(nèi)爆發(fā)，近三十年來國內(nèi)外聯(lián)合偽疫苗的使用和疫苗株和野毒株的區(qū)別診斷，并通過一系列清除計劃犬病有了較好的控制。在 2007 年 6 月，美國宣稱凈化根除了 PRV如荷蘭、奧地利、德國等也展開 PRV 凈化根除計劃(Morrison 1991)由卡介苗創(chuàng)始人劉永存首次分離得到偽狂犬病毒，目前為止已經(jīng)有狂犬病的爆發(fā)，地方性規(guī)模化豬場有比較嚴重的 PR 野毒感染情況，臨著較大壓力(伏彭 2016)。2011 年后由偽狂犬爆發(fā)的變異株引起的在ha-K61 的豬場爆發(fā)了偽狂犬病造成巨大經(jīng)濟損失(Yuan et al 2016)。，經(jīng)典的進口疫苗匈牙利株 Bartha-K61 不能在對 PRV 感染形成有l(wèi) 2018)。針對 2011 年底爆發(fā)的變異株，我國自主研發(fā)的疫苗已經(jīng)有

圖 1-2 免疫層析試紙示意圖Fig. 1-2 Schematic diagram of the immunochromatograp析技術(shù)的橫向免疫層析橫向免疫層析試紙條(LFICS)是一種可以直接通過肉眼觀察用以干燥形式存儲的試劑制備的試紙傳感器，具有檢測快速、點，是當前即時檢測的強大工具。目前，各種 LFICS 產(chǎn)品開生物醫(yī)學中的生物標志物，如蛋白質(zhì)、藥物和激素，食品安污染物，如生物毒素和病原體。傳統(tǒng)的免疫層析試紙條一般靈敏度和檢測線不足，如圖 1-3 所示隨著納米技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)析試紙條，這些類型包括有色納米顆粒(例如金納米顆粒 GNs 和膠體硒納米粒子 SNPs)、發(fā)光納米顆粒(例如量子點 QDs、

圖 1-3 基于納米顆粒的 LFICS 檢測策略的示意圖Fig1-3. Schematic illustration for LFICS detection strategies based on NPs1.2.3.2 膠體金免疫層析免疫膠體金層析技術(shù)是建立在膠體金技術(shù)、層析技術(shù)、免疫檢測技術(shù)結(jié)合起來的一種快速、高效、靈敏的即時檢測技術(shù)。膠體金免疫層析試紙條一般是以蛋白吸附較好的膜材料比如尼龍膜和硝酸纖維素(NC)或者聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜作為載體。其中最常用的是硝酸纖維素膜，相比較其他膜材料 NC 膜對蛋白具有較高的非特異性力(Kreplak et al 2007)并且在使用前無需處理，有良好的親水性，廣泛應用于微流體技術(shù)、免疫分析和生化分析(Gao et al 2014)。膠體金免疫層析試紙條的原理是基于酶聯(lián)免疫吸附試驗原理，但由于吸附材料及組成不同，膠體金測抗原或抗體原理較 ELISA 情況更復雜，需要綜合考慮膠體金標記抗體示蹤以及檢測線和質(zhì)控線上包被抗體蛋白的組合。對于病毒抗原的檢測一

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前7條

1 何啟蓋;童光志;楊漢春;張桂紅;姜平;張永光;張改平;伍少欽;章洪皸;;豬偽狂犬病流行病學特征、凈化技術(shù)及其應用示范[J];中國畜牧雜志;2015年24期

2 張文通;魏鳳;王金良;肖躍強;沈志強;;豬圓環(huán)病毒2型膠體金抗體檢測方法的建立[J];中國預防獸醫(yī)學報;2012年09期

3 張利勃;周鐵忠;王s

本文編號：2775751