【摘要】：布魯氏菌病(Brucellosis)是由布魯氏菌(.Brucella)屬的細(xì)菌侵入機(jī)體引起的一類(lèi)全球性分布的傳染-變態(tài)反應(yīng)性人畜共患傳染病。該病不僅會(huì)給畜牧業(yè)帶來(lái)重大的經(jīng)濟(jì)損失,還嚴(yán)重危害人類(lèi)健康。依據(jù)對(duì)宿主偏好性、培養(yǎng)特性以及生物學(xué)特性的不同,將布魯氏菌分為6個(gè)經(jīng)典的種,分別為牛種、羊種、豬種、犬種、綿羊附睪種和沙林鼠種,其中牛種和羊種是最為常見(jiàn)的人布病的病原體。目前布魯氏菌的分型方法主要有表型分型和基因分型,其中基因分型方法在布魯氏菌快速種型鑒定,病原的溯源分析以及菌株之間的差異與聯(lián)系等方面起到了重要作用。本研究旨在尋找一種快速、分辨率高的分型方法,對(duì)布魯氏菌臨床分離株進(jìn)行基因分型,分析菌株的遺傳多態(tài)性,建立菌株之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,為我國(guó)布魯氏菌病的分子流行病學(xué)和病原溯源研究提供依據(jù)。本研究通過(guò)收集臨床分離的23株布魯氏菌,綜合運(yùn)用16S rDNA、 AMOS-PCR.改良后的多位點(diǎn)序列分型(Multiple locus sequence typing,MLST)以及多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(Multilocus variable number tandem repeat analysis,MLVA)等技術(shù),對(duì)布魯氏菌進(jìn)行基因分型,分析各方法的特點(diǎn)并探討臨床分離株的遺傳進(jìn)化關(guān)系。23株布魯氏菌分離株的16S rDNA序列經(jīng)BLAST比對(duì)后,結(jié)果顯示與布魯氏菌的同源性最高,達(dá)到了99%以上。核酸序列相似性達(dá)到了99.85%,但不能區(qū)分種、型。采用AMOS-PCR對(duì)23株布魯氏菌分離株進(jìn)行種型鑒定,其中22株為羊種1、2或3型。1株為牛種1、2或4型。為了提高M(jìn)LST方法的分析效率,本研究通過(guò)重新設(shè)計(jì)引物,加長(zhǎng)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度,使擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度在750bp左右,建立了改良型MLST方法(EMLST).傳統(tǒng)MLST方法(CMLST)九個(gè)基因的有效序列長(zhǎng)度在422bp至589bp之間,而改良型MLST方法的有效序列長(zhǎng)度在611bp至759bp之間,改良型MLST方法每個(gè)基因參與分型的有效序列長(zhǎng)度增加了121bp-302bp,增加的比例在24.69%-71.56%之間。對(duì)23株布魯氏菌進(jìn)行了CMLST和EMLST的分析,CMLST方法定義了5個(gè)ST型,EMLST方法定義了10個(gè)ST型。九個(gè)基因中,glk、gyrB和Omp25基因增加了1個(gè)基因型。多態(tài)性位點(diǎn)的數(shù)量與該基因型別的多少成正比,通過(guò)加長(zhǎng)每個(gè)基因的擴(kuò)增序列,4個(gè)基因的多態(tài)性位點(diǎn)得到了增加。聚類(lèi)分析結(jié)果顯示,無(wú)論是基因型的分裂分解分析還是進(jìn)化分析,EMLST與CMLST相比,均具有更多的分支,說(shuō)明EMLST方法比CMLST方法的分型分辨率更高。國(guó)外來(lái)自30個(gè)國(guó)家的160株布魯氏菌,一共被定義了27個(gè)ST型。本研究23株分離株共有5個(gè)ST型,其中有2個(gè)ST型與國(guó)外菌株一致,另外3個(gè)ST型為本研究新發(fā)現(xiàn)ST型,命名為ST28、ST29、和ST30,其中ST28為本研究的優(yōu)勢(shì)ST型。本研究采用測(cè)序的方法對(duì)23株布魯氏菌分離株的16個(gè)多態(tài)性較高的MLVA位點(diǎn)進(jìn)行分析,使用MLVA-8分型結(jié)果顯示,22株為羊種,僅1株為牛種,其中羊種為115型,牛種為117型。使用MLVA-11和MLVA-16分型則沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與已知序列完全一致的基因型。對(duì)23株布魯氏菌臨床分離株16S rDNA、AMOS-PCR、CMLST、EMLST以及MLVA數(shù)據(jù)綜合分析表明：16S　rDNA序列同源性分析能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)布魯氏菌屬的準(zhǔn)確鑒定,對(duì)臨床快速診斷布魯氏菌病有重要作用,但不宜進(jìn)行布魯氏菌的種型鑒定。AMOS-PCR是一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的布病診斷方法,并能鑒定布魯氏菌的種和部分生物型。EMLST方法分型分辨率高于傳統(tǒng)MLST方法,可用于流行病學(xué)和菌群多態(tài)性研究,且適用于親緣性較遠(yuǎn)的布魯氏菌菌株。MLVA是本研究所有方法中分辨率最高的,適用于對(duì)親緣性較近的布魯氏菌進(jìn)行基因分型以及流行病學(xué)溯源。
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S852.61

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本文編號(hào)：2769654