發(fā)布時間：2020-07-24 21:49

【摘要】：牛呼吸道疾病綜合征(Bovine respiratory disease complex,BRDC)是一類對養(yǎng)牛業(yè)造成嚴(yán)重危害和經(jīng)濟(jì)損失的疾病。引起B(yǎng)RDC的病因復(fù)雜、病原繁多,包括病毒、細(xì)菌和支原體等,運(yùn)輸應(yīng)激和環(huán)境改變等因素是重要誘因。近年來,BRDC已經(jīng)成為制約國內(nèi)肉牛養(yǎng)殖的一個重要問題。本研究的目的是調(diào)查四川BRDC爆發(fā)的肉牛群中病原流行情況,分離鑒定牛傳染性鼻氣管炎病毒并建立可現(xiàn)場檢測該病毒的熒光PCR方法,為肉牛BRDC的防控提供參考,取得了以下成果:1.肉牛呼吸道疾病綜合征的病原檢測2016年10月~2018年3月,采集了四川省爆發(fā)BRDC的11個肉牛場108份深部鼻腔棉拭子,采用PCR方法分別檢測牛傳染性鼻氣管炎病毒(Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus,IBRV)、牛病毒性腹瀉病毒(Bovine Viral Diarrhoea Virus,BVDV)、牛冠狀病毒(Bovine Coronavirus,BCoV)、牛副流感3型病毒(Bovine Parainfluenza Virus type 3,BPIV3)、牛呼吸道合胞體病毒(Bovine Respiratory Syncytial Virus,BRSV)、牛腺病毒3型(Bovine Adenovirus type 3,BAV3)、牛支原體(Mycoplasma bovis,M.Bovis)、溶血性曼氏桿菌(Mannheimia haemolytica,M.haemolytica)、多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida,P.multocida)和睡眠嗜組織菌(Histophilus somni,H.somni)等10種病原,并鑒定M.haemolytica的莢膜血清型。檢測結(jié)果顯示IBRV、BVDV、BCoV、BPIV3、BAV3、M.Bovis、P.multocida、M.haemolytica、H.somni的陽性率分別為37%、16.7%、4.6%、5.6%、6.5%、24.1%、6.5%、46.3%、5.6%,BRSV未檢出;不同牛場檢出的病原種類有所差別,但I(xiàn)BRV、M.Bovis和M.haemolytica的平均陽性率和場陽性率較高,且混合感染較嚴(yán)重。莢膜血清6型和1型是M.haemolytica的優(yōu)勢莢膜血清型(38/50)。本研究結(jié)果為國內(nèi)肉牛BRDC的防控提供了參考。首次從國內(nèi)BRDC樣本中檢測到H.somni,豐富了國內(nèi)BRDC的病原譜。2.牛傳染性鼻氣管炎病毒的分離鑒定挑選10份IBRV陽性樣本,采用MDBK細(xì)胞進(jìn)行分離鑒定。接種后盲傳至4代時,其中一個樣本接種的細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞圓縮、拉網(wǎng)、聚集成葡萄串樣的細(xì)胞病變,傳至5代后,細(xì)胞病變穩(wěn)定。經(jīng)PCR方法和間接免疫熒光鑒定,確定該毒株為IBRV,命名為IBRV/2018/SMU6352。空斑純化后該毒株的病毒滴度為10~(8.25)TCID_(50)/mL。自行設(shè)計引物擴(kuò)增獲得了分離毒株的完整gB和gC基因序列(GenBank登錄號分別為MK654723和MK654724)。基于gB的遺傳進(jìn)化顯示該毒株為IBRV-1.2型。與GenBank中2019年3月18日前登錄的全部55條完整的IBRV gB基因序列(包括唯一國內(nèi)完整序列JN787952)比對發(fā)現(xiàn),該毒株gB基因序列在1576-1577位插入6個核苷酸(GCGACG),導(dǎo)致其氨基酸序列525-526之間插入兩個氨基酸(GD)。該插入發(fā)生在gB蛋白胞外區(qū),不在T細(xì)胞和B細(xì)胞識別位點區(qū)域,首次在國內(nèi)IBRV gB基因上發(fā)現(xiàn)這種突變現(xiàn)象。與GenBank中2019年3月18日前登錄的全部56條完整的IBRV gC基因序列(包括唯一國內(nèi)序列JN787953)比對發(fā)現(xiàn),該毒株gC基因核苷酸序列存在5個獨特的非同義替換(T614C、C712T、A833G、A1190G、A1247G),導(dǎo)致該蛋白出現(xiàn)5個獨特的氨基酸序突變(V205A、R238C、Q278R、E397G、E416G),可能會影響gC蛋白的免疫原性和該蛋白與細(xì)胞肝素樣受體結(jié)合能力。本實驗首次在國內(nèi)報道分離得到IBRV-1.2型毒株,且該毒株gB和gC氨基酸序列上存在獨特的變異,為了解國內(nèi)IBRV的遺傳進(jìn)化提供了參考,也為進(jìn)一步的IBRV疫苗研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。3.檢測IBRV的恒溫隔絕式熒光PCR方法的建立與應(yīng)用IBRV是OIE和我國進(jìn)出口及跨省貿(mào)易中要求檢疫的病原,但目前還未見可用于現(xiàn)場的PCR檢測方法。參考OIE推薦的熒光定量PCR方法的引物和探針,通過優(yōu)化反應(yīng)體系,首次建立了基于恒溫隔絕式熒光PCR(Insulated isothermal PCR,iiPCR)檢測IBRV的方法。結(jié)果顯示該方法只特異性檢出IBRV,而對BVDV、BPIV3、BRSV、BAV3、BCoV、M.Bovis、P.multocida和M.haemolytica等無關(guān)病原不檢出;檢測下限為2.4 copies/μL,并具有良好的重復(fù)性。對臨床樣品的檢測結(jié)果與OIE推薦的熒光定量PCR方法的檢測結(jié)果一致。該方法配合PetNAD核酸萃取試劑盒,從核酸提取到報告檢測結(jié)果僅需1 h,具有操作簡便、快速、可現(xiàn)場化的特點,為IBRV的現(xiàn)場檢測提供了一個可靠的方法。對9個省29份商品化凍精檢測結(jié)果顯示,IBRV陽性率為24%(7/29),表明我國流通的商品化凍精攜帶IBRV情況普遍,需要加強(qiáng)監(jiān)管。
【學(xué)位授予單位】：西南民族大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.653
【圖文】：

uler DAN Ladder；N：陰性對照；1~9：M. haemolyAN Ladder; N: Negative control; 1~9: Positive sample-1 部分 M.haemolytica 莢膜血清型 1、2 和 6 型鑒定entification results of the capsular serotypes 1, 2 and 6牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，肉牛養(yǎng)殖數(shù)目顯著增多，而由的影響，我國肉牛長距離、大范圍的調(diào)運(yùn)也病因復(fù)雜，不同病原引起的臨床癥狀相似，僅主要作用。國外已有大量關(guān)于 BRDC 多病原混haemolytica 和 BVDV 是美國和加拿大致 BRDni、BRSV 和 BCoV 是致巴西 BRDC 的主要病原發(fā) BRDC 的主要致病病原不同。本研究對采自鼻腔棉拭子樣本中 10 種病原檢測結(jié)果顯示場陽性率和平均陽性率均較高，說明IBRV、M

件等對 gB 和 gC 基因編碼區(qū)序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，使用 MEGA 7 軟件以Neighbor-Joining 法(Bootstrap 值為 1000)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，以了解 IBRV 分離株的 gB和 gC 基因與 GenBank 已公布的 IBRV 毒株之間的遺傳進(jìn)化關(guān)系。3 結(jié)果3.1 病毒分離及 PCR 方法鑒定結(jié)果將 10 份 IBRV 陽性深部鼻腔棉拭子接種于單層 MDBK 細(xì)胞中，盲傳 3 代后，PCR方法(張穎慧 等, 2018)檢測顯示 10 株細(xì)胞液中 6 株呈陽性。傳至 4 代時，有一株在36 h 左右出現(xiàn)與 IBRV 陽性對照相同的典型的細(xì)胞病變。病變初期細(xì)胞開始出現(xiàn)圓縮的現(xiàn)象，之后圓縮的細(xì)胞逐漸出現(xiàn)拉網(wǎng)狀，聚集成葡萄串樣，隨著時間的增加，在單層 MDBK 細(xì)胞上形成空洞，而正常的 MDBK 細(xì)胞陰性對照沒有發(fā)生病變，見圖 3-1。傳至 5 代后，細(xì)胞病變穩(wěn)定。通過 PCR 方法(張穎慧 等, 2018)檢測該病變株仍為陽性。

肉牛呼吸道疾病綜合征的病原檢測和 IBRV 恒溫隔絕式熒光 PCR 方法的建立與應(yīng)用3.2 間接免疫熒光鑒定結(jié)果通過間接免疫熒光鑒定，熒光顯微鏡下觀察可見，分離株和 IBRV 陽性對照毒株的細(xì)胞漿中均出現(xiàn)了明亮的特異性綠色熒光，而 MDBK 陰性對照則未出現(xiàn)綠色熒光如圖3-2。說明成功分離到1株致細(xì)胞病變的IBRV毒株，命名為IBRV/2018/SMU6352

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本文編號：2769436