【摘要】：H7N9亞型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)自2013年首次報(bào)道以來(lái),已導(dǎo)致我國(guó)人群中形成了五波流行高峰。截至2018年9月5日,實(shí)驗(yàn)室共確診1567例人感染H7N9的病例,死亡率接近40%。其中2016～2017年的第五波流行高峰感染人數(shù)最多、波及范圍最廣,在此期間還分離到了對(duì)雞呈高致病性的(Highly pathogenic,HP)的H7N9AIV。與在我國(guó)流行20多年的亞洲HP H5N1病毒相比,H7N9亞型AIV在短短5年時(shí)間內(nèi)造成的人類(lèi)感染數(shù)量已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)H5N1亞型AIV。人群中的H7N9散發(fā)病例均直接來(lái)自家禽感染。HP毒株和低致病性(Low pathogenic,LP)毒株并存的復(fù)雜狀況給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)和公共衛(wèi)生構(gòu)成了重大威脅,因此,研究我國(guó)家禽中H7N9亞型AIV的遺傳進(jìn)化特點(diǎn)和毒株的生物學(xué)特性并掌握其流行趨勢(shì)十分必要。因?yàn)槿祟?lèi)感染的H7N9AIV主要來(lái)自家禽,所以家禽中H7N9病毒的監(jiān)測(cè)和防控是控制和減少人類(lèi)感染的最有效措施,因此,快速檢測(cè)方法的建立及免疫原性良好的禽用疫苗儲(chǔ)備就顯得刻不容緩。同時(shí),研究H7N9亞型AIV對(duì)家禽的致病機(jī)制可以為更有效的防控策略提供科學(xué)依據(jù),家禽中同時(shí)存在的HP和LPH7N9病毒給新發(fā)現(xiàn)的PA-X蛋白功能的研究提供了良好的病毒模型。目前還沒(méi)有針對(duì)H7N9亞型AIV PA-X蛋白作用的研究,因此探索PA-X對(duì)H7N9病毒致病性及宿主抗病毒免疫的影響不僅能夠揭示PA-X蛋白在新型流感病毒感染中的關(guān)鍵作用,也能夠推進(jìn)H7N9病毒致病和制的研究。本研究在對(duì)我國(guó)雞群中H7N9亞型AIV進(jìn)行流行病學(xué)監(jiān)測(cè)的基礎(chǔ)上,對(duì)本實(shí)驗(yàn)室2013-2017年分離到的H7N9亞型AIVs進(jìn)行了遺傳進(jìn)化分析,并對(duì)部分HP H7N9進(jìn)行了生物學(xué)特性的鑒定。針對(duì)當(dāng)前H7N9流行現(xiàn)狀,成功構(gòu)建了免疫效力良好RGW疫苗候選株并建立了靈敏度高的且能區(qū)別H7N9強(qiáng)弱毒的MGB RRT-PCR檢測(cè)方法;同時(shí)研究了PA-X在高、低致病性H7N9病毒中調(diào)節(jié)復(fù)制能力和致病性的作用機(jī)理。1.2013年以來(lái)我國(guó)雞群中H7N9亞型禽流感病毒遺傳進(jìn)化及生物學(xué)特性分析根據(jù)2013年以來(lái)本實(shí)驗(yàn)室在我國(guó)部分雞場(chǎng)和活禽市場(chǎng)(Live poultry market,LPM)進(jìn)行的禽流感病原學(xué)監(jiān)測(cè),我們對(duì)2013～2017年分離到的116株H7N9亞型AIVs進(jìn)行了流行病學(xué)及遺傳進(jìn)化分析。研究表明,禽源H7N9病毒已經(jīng)在我國(guó)獲得常在性地方流行,家禽中H7N9的流行高峰時(shí)間和流行區(qū)域與人源H7N9類(lèi)似,進(jìn)一步證實(shí)了人源H7N9與禽源H7N9病毒高度同源。遺傳進(jìn)化樹(shù)顯示,監(jiān)測(cè)期間H7N9亞型AIV的HA基因和NA基因均按照分離年份進(jìn)行聚類(lèi)。但是第五波流行高峰期間(2016年10月～2017年3月)分離到的HP H7N9毒株卻獨(dú)立于2015年的進(jìn)化分支內(nèi)而與2016～2017年的分離株相距較遠(yuǎn),提示我們HP H7N9分離株可能來(lái)源于2015年的毒株。內(nèi)部基因進(jìn)化總體相對(duì)保守,大部分毒株的內(nèi)部基因均來(lái)源于優(yōu)勢(shì)S基因型的H9N2病毒,即PB2和M基因?qū)儆贕l-like譜系而其他內(nèi)部基因?yàn)镕98-like譜系。但值得注意的是,分離株P(guān)B2基因分成了兩個(gè)明顯的進(jìn)化分支且2015年部分毒株出現(xiàn)了 F98-like譜系的M基因,提示我們H7N9在進(jìn)化過(guò)程中仍然可能進(jìn)行著基因的重配。關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的分析顯示,在第五波流行高峰期間我們分離到了 7株裂解位點(diǎn)具有4個(gè)氨基酸插入的HP H7N9,這些病毒裂解位點(diǎn)的氨基酸序列存在兩種模式(PEVPKGKRTAR↓GLF和PEVPKRKRTAR↓GLF)。在重要的受體結(jié)合位點(diǎn)處,HA蛋白G186V及Q226L的變化意味著大部分禽源H7N9亞型AIV已經(jīng)具有結(jié)合人類(lèi)和禽類(lèi)的雙受體結(jié)合特性。HA抗原A區(qū)R140K突變比例逐年增多,提示我們H7N9,在進(jìn)化的過(guò)程中有可能已經(jīng)產(chǎn)生了抗原漂移。同時(shí),H7N9分離株P(guān)B2-K526R、PB1-1368V、PA-K356R、NS1-P42S的位點(diǎn)發(fā)生了普遍的或者逐年的變異,提示我們禽源H7N9已經(jīng)獲得了在小鼠中增殖和毒力增強(qiáng)的潛力,這些病毒如果一旦獲得在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的適應(yīng)將會(huì)對(duì)公共衛(wèi)生構(gòu)成巨大威脅。HPH7N9的生物學(xué)特性和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,分離株在對(duì)雞呈高致病性的同時(shí),對(duì)小鼠的毒力卻各不相同,GD15株在小鼠和雞中均呈現(xiàn)出了比GD4株更強(qiáng)的復(fù)制能力和毒力,這是否和其不同的裂解位點(diǎn)模式有關(guān)還需要進(jìn)一步研究。同時(shí)SPF雞感染傳播實(shí)驗(yàn)提示我們H7N9亞型AIV的傳播方式雖局限于接觸傳播,但傳播效率非常高。2.高致病性H7N9禽流感病毒疫苗候選株的構(gòu)建及基于Taqman-MGB探針RRT-PCR檢測(cè)方法的建立為了有效防控H7N9亞型AIV在家禽中流行與傳播,本研究根據(jù)當(dāng)前H7N9流行情況和遺傳進(jìn)化特點(diǎn),有針對(duì)性地構(gòu)建了免疫效力良好的RGW疫苗候選株并建立了鑒別診斷不同毒力H7N9病毒的Taqman-MGB探針RRT-PCR檢測(cè)方法。我們利用突變及反向遺傳手段成功構(gòu)建了重組致弱的疫苗株RGW,該疫苗株選擇了GD15的裂解位點(diǎn)致弱的HA和NA作為供體外部基因,內(nèi)部基因來(lái)源于同為S基因型的H9N2亞型疫苗株WJ57,還原性突變策略不僅使強(qiáng)毒株的毒力變?nèi)?同時(shí)也能保證其良好的免疫原性,使疫苗株RGW能同時(shí)預(yù)防高致病性H7N9和低致病性H7N9病毒的感染。RGW株保持了母本毒株良好的繁殖特性和免疫原性,經(jīng)10次傳代后依然具有l(wèi)1 log2的高效價(jià),在免疫雞后四個(gè)月后仍保持81og2的高滴度抗體。RGW不僅能對(duì)高致病性H7N9亞型流感病毒產(chǎn)生高滴度的HI抗體,對(duì)當(dāng)前流行的低致病性H7N9也有很好的交叉反應(yīng)性,交叉保護(hù)滴度均≥91og2。同時(shí),RGW疫苗株在具有100%臨床保護(hù)(死亡保護(hù))的前提下,其排毒保護(hù)也能高達(dá)80%～100%,可以有效控制H7N9病毒在雞群中流行及傳播,從而也可以減少人類(lèi)與禽類(lèi)接觸而感染病毒。當(dāng)前H7N9亞型禽流感病毒存在著高致病性毒株和低致病性毒株共同流行的現(xiàn)狀,快速區(qū)分強(qiáng)弱毒H7N9檢測(cè)方法的建立極為必要。因此我們基于Taqman-MGB探針技術(shù)建立了一種可以鑒別診斷不同毒力H7N9的雙通道RRT-PCR方法,該方法首次將MGB探針技術(shù)用于H7N9病毒的檢測(cè)。Taqman-MGB探針相比于普通RRT-PCR方法有著更高的靈敏度,本方法針對(duì)不同毒力H7N9的不同模式裂解位點(diǎn)序列設(shè)計(jì)了探針,在雙通道條件下能夠高效地特異性檢測(cè)HP-H7N9及LP-H7N9并達(dá)到區(qū)分的效果,靈敏度達(dá)50拷貝。相比于傳統(tǒng)的雞胚分離和RT-PCR方法,該方法總符合率達(dá)92.7%且敏感性更好,臨床操作更加簡(jiǎn)便快速,同時(shí)又避免了傳統(tǒng)方法中可能存在的交叉污染。3.PA-X蛋白在高、低致病性H7N9禽流感病毒感染中的作用及其機(jī)制研究為了探索PA-X蛋白在不同致病性H7N9病毒感染過(guò)程中的作用,我們以高致病性毒株A/chicken/Guangdong/GD15/2016(GD15)及其裂解位點(diǎn)致弱的低致病性毒株r15為研究對(duì)象,通過(guò)對(duì)PA基因核糖體移碼區(qū)的改造,成功構(gòu)建了 PA-X表達(dá)量下降的高致病性突變病毒GD15-PAX3、GD15-PAX5和低致病性突變病毒r15-PAX3、r15-PAX5。本研究系統(tǒng)地比較了母本病毒和突變毒株在病毒感染過(guò)程中的差異。當(dāng)以高致病性毒株為骨架時(shí),與母本病毒GD15比,突變病毒GD15-PAX3、GD15-PAX5對(duì)SPF雞胚的毒力增強(qiáng),在MDCK和DF-1細(xì)胞和SPF雞體內(nèi)的復(fù)制能力增強(qiáng);在哺乳動(dòng)物和禽類(lèi)細(xì)胞中的聚合酶活性增強(qiáng);同時(shí)在病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡能力方面也增強(qiáng);然而,雞的肺臟差異轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析結(jié)果顯示,GD15-PAX3所誘導(dǎo)的宿主先天性免疫應(yīng)答能力卻低于母本病毒,主要表現(xiàn)在GD15-PAX3誘導(dǎo)的顯著差異表達(dá)的基因個(gè)數(shù)要低于母本病毒GD15,并且刺激宿主IL-6、IL-18、INF-β等重要炎性細(xì)胞因子應(yīng)答水平也顯著低于母本病毒。因此,當(dāng)以高致病性毒株為骨架時(shí),PA-X能顯著抑制病毒的復(fù)制能力和病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,增強(qiáng)了宿主的先天性免疫應(yīng)答能力。然而,當(dāng)以低致病性毒株為骨架時(shí),大部分結(jié)果與以高致病性毒株為骨架的結(jié)果相反,主要體現(xiàn)在,與母本病毒r15相比,突變病毒rl5-PAX3、r15-PAX5在體內(nèi)和體外的復(fù)制能力、在哺乳動(dòng)物和禽類(lèi)細(xì)胞中的聚合酶活性、在病毒誘導(dǎo),的細(xì)胞凋亡能力方面均顯著降低。但是,雞的肺臟差異轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析結(jié)果顯示,r15-PAX3所誘導(dǎo)的宿主先天性免疫應(yīng)答差異基因的個(gè)數(shù)要低于母本病毒r15,但是IL-6、IL-18、TNF-α等重要的炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平卻顯著提升。因此,當(dāng)以低致病性毒株為骨架時(shí),PA-X能顯著增強(qiáng)病毒的復(fù)制能力和病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,抑制宿主的先天性免疫應(yīng)答能力。因此,本章的研究結(jié)果首次發(fā)現(xiàn)PA-X蛋白在HP/LP H7N9病毒中起到調(diào)節(jié)復(fù)制能力和病毒毒力的作用,并且發(fā)現(xiàn)H7N9病毒PA-X蛋白無(wú)法誘導(dǎo)雞肺臟顯著的“Host shutoff'活性,推測(cè)PA-X蛋白抑制宿主蛋白表達(dá)的能力可能存在宿主或亞型特異性。同時(shí)我們的結(jié)果也表明PA-X可能通過(guò)調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子的應(yīng)答水平和不同程度的細(xì)胞凋亡來(lái)調(diào)節(jié)高/低致病性H7N9病毒的復(fù)制能力和致病性。因此,本研究推進(jìn)了我們對(duì)HP/LP H7N9病毒致病機(jī)制的了解。
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S852.65
【圖文】：

ＰＡ－Ｘ蛋白是一種融合蛋白，包括源自ＰＡ蛋白Ｎ－末端的１９１個(gè)氨基酸的前導(dǎo)序列和逡逑重疊的開(kāi)放閱讀框（Ｏｐｅｎ－ｒｅａｄｉｎｇ邋ｆｒａｍｅ，ＯＲＦ）編碼的４１邋（或６１）個(gè)密碼子的Ｃ－末端區(qū)逡逑域（“Ｘ－ＯＲＦ”），該Ｘ－ＯＲＦ通過(guò)ＰＡ基因中的一個(gè)核糖體移碼形成（圖１）邋［｜｜】。根據(jù)Ｘ－ＯＲＦ逡逑長(zhǎng)度的譜系特異性差異，學(xué)者們對(duì)兩個(gè)主要的Ｘ－ＯＲＦ組進(jìn)行了分類(lèi)，大約７５％分離株的逡逑Ｘ－ＯＲＦ具有６１個(gè)密碼子，基本涵蓋了所有宿主物種和ＨＡ／ＮＡ亞型，其余的２５％分離株逡逑攜帶截短形式的ＰＡ－Ｘ邋（４１個(gè)密碼子Ｘ－ＯＲＦ），主要由于第４２個(gè)密碼子發(fā)生的無(wú)義突變逡逑

而且對(duì)公共衛(wèi)生構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅為了確定ＰＡ－Ｘ序列中是否存在亞型特異性逡逑特征，Ｈｕ等人卿的研宄比較了不同病毒亞型中ＰＡ－Ｘ中特定氨基酸的變異率，發(fā)現(xiàn)某些特逡逑定變異在某些亞型中高度富集。如（圖２ａ）所示，Ｈ７Ｎ９和Ｈ９Ｎ２亞型中位置３７Ａ，６１１，逡逑１０１Ｄ，１９３Ｎ，１９５Ｒ，邋１９９Ｒ和２２８１的變異率高于Ｈ５Ｎ１和Ｈ５Ｎ６亞型，其中Ｈ７Ｎ９病毒的逡逑變異率最高，在該７個(gè)位點(diǎn)中幾乎達(dá)到１００％邋（圖２ａ）。同樣地也有一些一些氨基酸位點(diǎn)逡逑（２７Ｄ，５８Ｇ，邋１２９１，２０８Ｑ，２１３Ｇ和２１５Ｐ）更傾向于在Ｈ５Ｎ１和Ｈ５Ｎ６中發(fā)生變異，而不逡逑是Ｈ９Ｎ２和Ｈ７Ｎ９病毒，特別是在Ｈ５Ｎ１病毒中變異更加普遍（圖２ｂ）。有趣的是，其中逡逑一小組氨基酸位點(diǎn)（２０Ａ，１４２Ｋ和２５１Ｋ）在禽類(lèi)Ｈ５Ｎ６病毒中顯示出比其他亞型更高的逡逑變異率（圖２ｃ）。根據(jù)對(duì)以上位點(diǎn)變異率的分析，可以看出ＰＡ－Ｘ變異模式在Ｈ９Ｎ２和Ｈ７Ｎ９逡逑亞型之間以及Ｈ５Ｎ１和Ｈ５Ｎ６亞型之間非常相似。此外，一些變異富集傾向于特定的病毒逡逑亞型。因此研宄ＰＡ－Ｘ多態(tài)性在調(diào)節(jié)不同亞型和不同毒力的流感病毒中的作用將幫助我們逡逑進(jìn)一步闡明ＰＡ－Ｘ在ＩＡＶ致病性中的潛在機(jī)制。逡逑

我國(guó)雞群中Ｈ７Ｎ９亞型禽流感病毒的遺傳進(jìn)化及ＰＡ－Ｘ蛋白在高、低致病性毒株感染中的作用和機(jī)制研究邐４５逡逑應(yīng)較高）。裂解位點(diǎn)有插入的高致病性Ｈ７Ｎ９毒株均分離于兩廣及其鄰近地區(qū)，因此我們認(rèn)逡逑為珠江三角洲地區(qū)可能是高致病性Ｈ７Ｎ９亞型ＡＩＶ的發(fā)源地（圖１－丨－丨）。從Ｈ７Ｎ９的病毒分逡逑離率可以看出，Ｈ７Ｎ９亞型ＡＩＶ每年均能分離到，且分離率逐年提升，己經(jīng)形成常在性地方逡逑流行態(tài)勢(shì)（圖１－１－２）。在冬季（１２月、１月、２月），春季（３月、４月、５月）Ｈ７Ｎ９亞型ＡＩＶ逡逑分離率較高，與人感染病例數(shù)隨季節(jié)性升高相一致（圖１－１－３）。因此，流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，逡逑Ｈ７Ｎ９亞型ＡＩＶ給養(yǎng)禽業(yè)和人類(lèi)帶來(lái)了雙重威脅，具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。逡逑

本文編號(hào)：2765004