【摘要】：吩噻嗪類藥物在養(yǎng)殖業(yè)中的非法使用會(huì)造成此類藥物在動(dòng)物源性食品中的殘留,從而危害人類健康。在眾多殘留分析方法中,酶免疫分析法是最常用的快速篩選法。要建立針對(duì)吩噻嗪類藥物的多殘留酶免疫分析法,制備一種廣譜識(shí)別性抗體至關(guān)重要。本研究以2-氯吩噻嗪為半抗原,制備了一株廣譜單克隆抗體。間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)表明,該單克隆抗體可以同時(shí)識(shí)別氯丙嗪、異丙嗪、乙酰丙嗪、奮乃靜和氟奮乃靜等5種吩噻嗪類藥物,IC_(50)為1.22~500 ng/mL,交叉反應(yīng)率為0.4~98%。然后,從雜交瘤細(xì)胞中提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,擴(kuò)增出抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)基因,拼接成單鏈抗體基因(ScFv),將其插入到BL21(DE3)菌中表達(dá)出ScFv抗體。間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)表明,該ScFv抗體對(duì)5種藥物的IC_(50)為1.31~56 ng/mL,交叉反應(yīng)率為2.3~99.2%,與母源單克隆抗體相當(dāng)。利用YASARA軟件將該ScFv抗體與5種藥物分別進(jìn)行對(duì)接,結(jié)果顯示,抗體結(jié)合腔主要由重鏈CDR3和輕鏈CDR1、CDR2、CDR3區(qū)組成,關(guān)鍵接觸氨基酸為Arg101、Tyr102、Tyr162、Phe164、Tyr179、Leu180、Trp221,疏水作用力是主要的分子間作用力。然后,利用定點(diǎn)突變技術(shù)將輕鏈CDR2的Phe164突變?yōu)镻ro164,制備出一種ScFv突變體。間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)表明,該突變體對(duì)5種藥物親和力得到較大的提升,IC_(50)為0.4~5.1 ng/mL。利用該抗體建立的ELISA法可以檢測(cè)肉組織中的這5種吩噻嗪類藥物,檢測(cè)限為0.1~1.8 ng/g,添加回收率為66.4~97.2%。本試驗(yàn)基于基因工程和計(jì)算模擬的方法,探究了單鏈抗體的分子識(shí)別機(jī)制,并對(duì)其定向進(jìn)化,為研究其他小分子物質(zhì)的分子識(shí)別機(jī)制及體外進(jìn)化奠定了基礎(chǔ),對(duì)保障動(dòng)物源性食品安全具有重要意義。
【學(xué)位授予單位】：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S859.84

【參考文獻(xiàn)】

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