【摘要】：肝炎-心包積水綜合征(Hepatitis-hydropericardium syndrome,HHS)是由禽腺病毒血清4型(Fowl adenovirus 4,FAdV-4)引起的以肝炎、心包積水為特征的疾病。自2015年以來,HHS在我國大面積流行,給我國養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴重的經濟損失。然而關于FAdV-4的毒力基因則研究較少。為探討ORF17基因對FAdV-4復制和毒力的影響,本研究以FAdV-4流行毒株HN/15102株為親本病毒,采用同源重組技術構建ORF17基因缺失的重組病毒。首先將表達EGFP的pΔORF17-EGFP轉染已感染HN/151025的雞肝癌細胞(LMH),構建重組病毒rHN-ΔORF17-EGFP。再將EGFP表達盒去除,經蝕斑反向篩選獲得rHN-ΔORF17。將rHN-ΔORF17在LMH細胞上連續(xù)傳代20代,每5代進行PCR檢測,結果表明rHN-ΔORF17遺傳穩(wěn)定。生長動力學曲線測定結果表明2株重組病毒與親本病毒的生長動力學趨勢基本一致,均在接種后96 h病毒滴度達到高峰。rHN-ΔORF17與親本病毒HN/151025病毒滴度相近,分別為2.22×10~8 PFU/mL和4.26×10~8 PFU/mL,表明ORF17基因缺失不影響病毒復制能力;而rHN-ΔORF17-EGFP滴度顯著下降(1.53×10~6PFU/mL)與親本病毒HN/151025差異顯著(P0.05)。中國分離株FAdV-4與加拿大ON1弱毒株相比,基因組3′端缺失1966-bp序列(ORF19和ORF27),為了解該自然缺失對病毒毒力的影響,本研究以基因組3′端35430-35431位點自然缺失1966-bp序列的HN/151025為親本病毒,構建表達EGFP的重組病毒rHN-Δ35430-EGFP。然后將1966-bp序列替換EGFP表達盒,構建補足ON1株來源的1966-bp序列的重組病毒rHN-Δ35430-ON1。rHN-Δ35430-ON1在LMH細胞上連續(xù)傳代20代,每5代進行PCR檢測,結果表明rHN-Δ35430-ON1遺傳穩(wěn)定。重組病毒生長動力學曲線測定結果表明2株重組病毒與親本病毒的復制動力學趨勢基本一致,均在接種后96 h病毒滴度達到高峰。rHN-Δ35430-EGFP滴度為6.8×10~7PFU/mL,rHN-Δ35430-ON1滴度(2.66×10~8 PFU/mL)與親本病毒HN/151025(4.26×10~8 PFU/mL)相近,說明插入1966-bp序列不影響病毒復制。對rHN-ΔORF17和rHN-Δ35430-ON1進行致病性評價。將40只28日齡SPF雞隨機分成4組,其中3組分別用rHN-ΔORF17、rHN-Δ35430-ON1和HN/151025通過滴鼻點眼途徑進行攻毒,攻毒劑量為0.1 mL 8×10~5 PFU,對照組為等體積無菌PBS,攻毒后觀察雞只癥狀。攻毒后第3 d,rHN-ΔORF17和HN/151025組雞只開始出現(xiàn)臨床癥狀,rHN-Δ35430-ON1組雞只于攻毒后第4 d出現(xiàn)臨床癥狀,發(fā)病雞只表現(xiàn)為精神沉郁、縮脖、羽毛蓬亂、喜臥嗜睡等;攻毒組發(fā)病率均為100%,發(fā)病高峰期均在攻毒后第4~6 d,攻毒后第14 d各組雞只逐漸開始康復。攻毒組中,HN/151025組死亡率為10%,rHN-ΔORF17組死亡率為20%,rHN-Δ35430-ON1組死亡率為10%,對照組為0。對死亡雞只進行病理剖檢,攻毒組均表現(xiàn)心包積液、肝臟黃色壞死灶、腎腫大,無明顯差異。免疫組化攻毒組肝臟均檢測到抗原。攻毒后第4~28 d,每4 d采集咽肛拭子和血清抗體。咽肛拭子排毒檢測中,3組攻毒組雞只均在第4~20 d檢測到100%排毒,第24 d排毒下降,3組表現(xiàn)一致。血清抗體檢測中,整體抗體水平無差異,僅在抗體陽轉率存在差異。HN/151025組陽轉率最高達88.9%,rHN-ΔORF17組陽轉率最高為50%,rHN-Δ35430-ON1陽轉率最高為33.3%。在第32 d進行第2次攻毒,3組均無明顯臨床癥狀�？贵w陽轉率也無明顯差異。咽肛拭子排毒,第4~27d排毒率100%,第34~55 d下降后上升,在第62 d排毒率達100%,3組表現(xiàn)一致,無明顯差異,且均排毒反復,排毒期長。上述結果表明,2株重組病毒對雞的致病性與親本病毒差異不顯著。綜上,ORF17基因缺失和插入自然缺失1966-bp序列對病毒復制和致病性均無影響。
【學位授予單位】：中國農業(yè)科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S852.65
【圖文】：

中國農業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 引言4 基因組與 FAdV-1 相似，基因組編碼 2 個 fiber 基因，fiber 基因帶有特異性抗原決定簇，且可能與病毒毒力有關（Pallister et al., 1996; Park et al., 2017）�；蚪M 3′端主要編碼非結構蛋白 ORF4、ORF8、ORF16-17、ORF19-20、ORF22、ORF27~30、ORF42-43、ORF48-49，大部分基因結構功能未知，有待探索。已研究過的 ORF8 編碼 GAM-1 蛋白，且 FAdV-1 GAM-1 被證實為抗凋亡蛋白，其功能類似于 Bcl-2 和人腺病毒 E1B-19K，可阻斷細胞凋亡（Chiocca et al., 1997）；ORF22 編碼與視網膜母細胞瘤蛋白相互作用的蛋白，類似于人腺病毒 E1A 蛋白，與 GAM-1 配合激活 E2F 通路（Lehrmann et al., 1999）。

中國農業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 引言存在超過 20 個突變（Li et al., 2018）。中國流行的 FAdV-4 病毒基因組 3′端存在大段基因 1966-bp序列（與 ON1 和 KR5 毒株相比）或 1964-bp 序列（與 MX-SHP95 強毒株相比）的缺失，在HN//151025毒株中，該缺失位于基因組的35430-35431位點，缺失的片段中包含ORF19和ORF27，其中弱毒株 ON1 和 KR5 毒株具有完整的 ORF19 基因，國外強毒株 MX-SHP95 的 ORF19 被分為3 段 Lip-1、Lip-2 和 Lip-3（Vera-Hernandezetal.,2016），而國內分離的強毒株均普遍缺失 ORF19基因，而弱毒株 ON1、KR5 和強毒株 MX-SHP95 均包含 ORF27 基因。由目前公布的毒株可以看出無致病性的毒株具有完整 ORF19 基因，而高致病性毒株不具有完整 ORF19 基因。同時 ORF19基因編碼 Lipase 同系物，是馬立克氏病病毒的毒力因子（Kamil et al., 2005），因此推測中國此次流行的高致病性 FAdV-4 主要是因為 ORF19 基因的缺失。

出無致病性的毒株具有完整 ORF19 基因，而高致病性毒株不具有完整 ORF19 基因。同時 ORF19基因編碼 Lipase 同系物，是馬立克氏病病毒的毒力因子（Kamil et al., 2005），因此推測中國此次流行的高致病性 FAdV-4 主要是因為 ORF19 基因的缺失。圖 1.2 中國流行毒株 FAdV-4 與國外非致病性毒株基因組 3′端缺失 1966-bp 序列比對結果Figure 1.2 1966-bp sequence deletion at the 3 -end of the Chinese FAdV-4 isolates genome comparing with thenonpathogenic strains還發(fā)現(xiàn) 2015 年后中國 FAdV-4 分離株 ORF29 基因與 ON1 毒株相比缺失 66 bp，與 KR5 和MX-SHP95 相比缺失 33 bp（Ye et al., 2016）。除此之外，中國分離株的重復區(qū)域中還存在缺失，其中 FAdV-4 中國分離株 JSJ13，缺失 TR-1 和 TR-2（Zhaoetal.,2015）。在基因組的 3′端的 ORF17基因，強毒與弱毒存在多個位點的差異，可能與毒力相關。

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