【摘要】：狂犬病,一種古老而流行廣泛的神經(jīng)疾病,它影響到差不多所有種類的哺乳動(dòng)物,包括人類。引起這種疾病的原因是狂犬病病毒(rabies virus,RABV),它是彈狀病毒科,狂犬病病毒屬的成員。RABV的基因組長度11927nt,包含5個(gè)單順反子RNAs,分別編碼:核蛋白、磷酸化蛋白、基質(zhì)蛋白、糖蛋白和大蛋白。在這些單順反子之間是4個(gè)長度不相同的基因間隔區(qū),間隔區(qū)分別含有2、5、5、423個(gè)核苷酸。單股負(fù)鏈的RABV基因組結(jié)構(gòu)相對(duì)簡單,因此對(duì)其基因組的操作會(huì)更方便。但是相比于同為彈狀病毒科的水泡型口炎病毒,RABV的基因間隔區(qū)的堿基序列具有不平衡的特點(diǎn)。RABV基因間隔區(qū)的不均衡對(duì)病毒到底是怎樣的影響,是值得我們思考和研究的問題。本課題運(yùn)用RABV的反向遺傳的操作系統(tǒng)對(duì)RABV的CVS-11株的基因間隔區(qū)進(jìn)行遺傳改造,構(gòu)建狂犬病病毒CVS-11株間隔區(qū)縮短的缺失株,并進(jìn)一步探究該毒株間隔區(qū)的縮短對(duì)CVS-11株各方面特性的影響。通過對(duì)本實(shí)驗(yàn)保存的狂犬病病毒弱毒株CVS-11株進(jìn)行序列測(cè)定,對(duì)其基因間隔區(qū)的堿基進(jìn)行遺傳改造,使得各蛋白間的基因間隔區(qū)核苷酸是CT,分4段對(duì)其全長進(jìn)行擴(kuò)增,然后利用In-fusion技術(shù)進(jìn)行同源重組進(jìn)而完成重組病毒全長基因組的真核表達(dá)載體的構(gòu)建,用兩對(duì)特異性的引物經(jīng)過菌液PCR的擴(kuò)增鑒定,分別得到1570 bp和850 bp的目的條帶,證明同源重組成功。然后將N、P、L及G蛋白4個(gè)輔助表達(dá)質(zhì)粒與構(gòu)建的狂犬病病毒CVS-11間隔區(qū)縮短的缺失株的全長質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BSR-T7細(xì)胞系,進(jìn)行重組病毒拯救,直接免疫熒光檢測(cè)鑒定,最后于熒光顯微鏡下我們看到了特異性的熒光,證明狂犬病病毒CVS-11株間隔區(qū)縮短的缺失株得到成功拯救并且能夠在BSR-T7細(xì)胞系中表達(dá)。通過對(duì)重組病毒的G、L蛋白的基因之間的間隔區(qū)進(jìn)行RT-PCR得到820bp大小的目的條帶,證實(shí)狂犬病病毒CVS-11株間隔區(qū)縮短的缺失株在細(xì)胞中得到穩(wěn)定地轉(zhuǎn)錄。取重組病毒和原毒株CVS-11的細(xì)胞培養(yǎng)物,于透射電鏡下均可觀察到RABV粒子的典型特征。通過繪制重組病毒和原毒株在不同的病毒感染數(shù)時(shí)證明,重組病毒的病毒表現(xiàn)出與原毒株相似的復(fù)制特點(diǎn),但重組病毒的滴度低于原毒株。將重組病毒和原毒株分別以1×10~7TCID_(50)/mL和1×10~6TCID_(50)/mL的量對(duì)小鼠進(jìn)行外周的肌肉攻毒,10只/組,病毒感染6天后,記錄發(fā)病和死亡情況。結(jié)果顯示狂犬病病毒CVS-11株間隔區(qū)縮短的缺失株對(duì)小鼠的致死力較強(qiáng),存活率較低,差異較顯著。將1×10~(7。5)TCID_(50)/mL的重組病毒和原毒株滅活后加鋁佐劑免疫小鼠,10只/組,14天后,眼球采血,分離血清,采用熒光抗體中和試驗(yàn)檢測(cè)抗體,結(jié)果顯示狂犬病病毒CVS-11間隔區(qū)的縮短對(duì)其有影響,但是差異性并不顯著。本課題成功構(gòu)建了狂犬病病毒CVS-11株間隔區(qū)縮短的缺失株并對(duì)其生物學(xué)特性、免疫原性進(jìn)行了研究,結(jié)果證實(shí)了狂犬病病毒CVS-11株間隔區(qū)的縮短對(duì)原毒株在細(xì)胞上的復(fù)制以及免疫原性方面沒有顯著的影響,但是能夠增強(qiáng)小鼠的致病力,影響較明顯。
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.65
【圖文】：

是 mRNA 的起始部位，最終形成 mRNA 5'端的帽子結(jié)構(gòu)，基有一段保守的 U7 序列，轉(zhuǎn)錄后形成 mRNA3'端的 polyA。隔區(qū)BV 不同基因之間，其基因間隔區(qū)的長度都不相同，在病毒的 N、 P、L 各蛋白基因之間，分別有 2、5、5、 423 nt 的間隔區(qū)，而同病毒科中口炎病毒的基因間隔區(qū)均為 2nt，為 GA 或 CA，因此 RABV 的基因間不均衡性特征。狂犬病病毒基因間隔區(qū)的不均衡性對(duì)病毒本身產(chǎn)生怎樣值得我們思考和進(jìn)一步研究。

之后 MVA-T7 被廣泛地應(yīng)用在負(fù)鏈 RNA 病毒的拯救（如圖1.2）。隨著反向遺傳操作技術(shù)的成熟，2003 年，Ito 等在 Schnell 的研究基礎(chǔ)上，利用 BSR 細(xì)胞系替代痘病毒來表達(dá) T7RNA 聚合酶，啟動(dòng) T7 啟動(dòng)子，進(jìn)行病毒的拯救。但是因?yàn)榻⒓?xì)胞系的工作任務(wù)比較繁重，同年，Morimoto 等通過細(xì)胞 RNA 聚合酶 II 完成對(duì) CMV 啟動(dòng)子的啟動(dòng)，高效的拯救出了 HEP-Flury 株狂犬病病毒，同時(shí)避免了痘病毒的使用和構(gòu)建細(xì)胞系的工作，該方法雖然拯救效率高，但是具有一定的局限性，需要設(shè)計(jì)出高效特異的核酶來保證拯救事件的成功發(fā)生。雖然反向遺傳研究系統(tǒng)已經(jīng)發(fā)展的比較成熟，但是目前仍有一定的局限性，對(duì)于病毒拯救方面還需要各種條件的探索、優(yōu)化。圖 1.2 負(fù)鏈 RNA 病毒拯救系統(tǒng)Figure .1.2 System for the generation of negative-sense RNA viruses from clonedcDNA2.2 反向遺傳技術(shù)在負(fù)鏈 RNA 病毒的應(yīng)用反向遺傳學(xué)在 RABV 基因組方面的操作使我們能夠研究 RABV 更多的領(lǐng)域

表 1-3 RABV CVS-11 株間隔區(qū)縮短的缺失株各蛋白基因特異性擴(kuò)增引物Table 1-3 Specific primers for amplification of protein genes of missing strainswith shortened spacer region of cvs-11 strain 引物序列（5’-3’） 目的片F(xiàn) ACGCTTAACAACAAAACCAG Le+NP R TTTATCAGTGGTGTTAGTTTTTTTCATGTCTACTCCACTAACACCACTGATAAAATG M 基CTTTTGAGGGATGTTAGTTTTTTTCACATCCAAGAGGCTAACATCCCTCAAAAGACT G 基TGGATGAGAAGTGTTAGTTTTTTTCTTCACAGTCTGACTAACACTTCTCATCCAGAG L ACGCTTAACAAAAAAACAAT

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

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相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

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本文編號(hào)：2761530