【摘要】：偽狂犬病病毒為雙股DNA病毒,隸屬于皰疹病毒科、α-皰疹病毒亞科,全長約150 kb,GC含量高達(dá)73%。豬偽狂犬病是由豬偽狂犬病病毒引起的以神經(jīng)癥狀、繁殖障礙為主要特征的嚴(yán)重危害我國養(yǎng)豬業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展的疾病,在我國各省規(guī)�；i場普遍存在。據(jù)童武2013年報道,自2011年以來中國各省先后發(fā)生PR疫病,且免疫PRV疫苗的豬場仍發(fā)生,發(fā)病率和死亡率明顯上升,毒株分離鑒定結(jié)果顯示,引起該病大規(guī)模爆發(fā)的病原為變異的豬偽狂犬病毒。貴州省部分已免疫PRV Bartha-K61疫苗株的豬場,也發(fā)生類似的PR疫病。2016年貴州省丹寨縣某規(guī)模化種豬場,在已免疫PRV Bartha-K61疫苗的情況下,部分種豬先后發(fā)生流產(chǎn)、產(chǎn)死胎和木乃伊胎,后經(jīng)實驗室診斷確診為感染PRV野毒所致。為了解該病例中PRV毒株的情況,本研究應(yīng)用Vero細(xì)胞對其進(jìn)行了分離和鑒定,證實該分離毒株系一株P(guān)RV變異毒株(GZDZ2016),并基于該毒株基因序列構(gòu)建了TK基因缺失轉(zhuǎn)移載體,為PRV變異株TK基因缺失疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。1.PRV變異株GZDZ2016的分離鑒定本研究取2016年丹寨縣某豬場送檢的經(jīng)實驗室確診為PRV陽性的流產(chǎn)胎兒組織樣品,經(jīng)系列處理后接種于Vero細(xì)胞進(jìn)行傳代分離,并應(yīng)用電鏡技術(shù)對分離的PRV進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,對病毒效價、一步生長曲線及部分基因序列等進(jìn)行了測定。分離鑒定結(jié)果顯示,當(dāng)盲傳至第5代時開始產(chǎn)生CPE,至第7代時呈現(xiàn)穩(wěn)定的CPE,表現(xiàn)為細(xì)胞變圓、脫落、呈拉網(wǎng)狀等典型CPE;透射電鏡下可見位于囊泡中呈近似圓形的成熟病毒粒子,在胞核中可見衣殼呈晶格狀排列的病毒包涵體以及空心、實心2種無囊膜的病毒粒子;分離的病毒在Vero細(xì)胞上的生長滴度為10~(-8.12)/0.1mL,一步生長曲線顯示該病毒滴度在12 h內(nèi)處于潛伏期,從12 h以后到56 h之間呈增長趨勢,至60 h滴度達(dá)最大;將分離毒株接種家兔,2天后出現(xiàn)奇癢、亢奮的癥狀,3天后死亡;后取保存?zhèn)溆玫牡?1代細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行g(shù)D部分基因的擴(kuò)增,并對測序結(jié)果進(jìn)行分析,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序證明系PRV gD基因的部分序列。結(jié)果表明,成功分離獲得了1株豬偽狂犬病病毒貴州株,命名為PRV GZDZ2016株。本試驗通過設(shè)計合成特異性引物,通過PCR方法擴(kuò)增了分離株的gB、gC、gD、gE和TK基因,預(yù)期大小分別為:2784bp、1651 bp、1273 bp、、1752 bp、1535 bp,并對gC、gD、gE和TK基因進(jìn)行克隆測序,將測序結(jié)果與國內(nèi)外毒株基因序列進(jìn)行比對和序列相似性分析,用推導(dǎo)的氨基酸序列繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。序列相似性分析結(jié)果表明:該分離株主要基因與變異株相似性較高,而與國外毒株相似性較低。序列比對結(jié)果顯示,該分離株gB、gC、gE和TK蛋白分別有不同數(shù)量的氨基酸的變異,gE蛋白第48位和496位均有天冬氨酸(D)的插入,第236位由亮氨酸(L)變?yōu)楦彼?P);TK蛋白第6位由異亮氨酸(I)變?yōu)楸彼?A),第157位由天冬氨酸(D)變?yōu)楦拾彼?G);gC蛋白第81位由組氨酸(V)變?yōu)楸彼?A);gB蛋白與國外毒株在第55、70、72~73等位存在明顯的氨基酸差異;gD蛋白與2012年后分離的HeN1、TJ、JS2012株等變異毒株未存在氨基酸差異。遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示,該分離株與國內(nèi)近年來分離的變異毒株親緣關(guān)系較近,而與國內(nèi)外分離的經(jīng)典毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。以上結(jié)果均表明,該分離株屬于國內(nèi)近幾年流行的變異毒株,命名為PRV變異株GZDZ2016。2.PRV變異株GZDZ2016 TK基因缺失轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建設(shè)計特異性引物分別擴(kuò)增PRV變異株GZDZ2016 TK基因上下游同源臂TKL、TKR,大小分別為1066 bp、906 bp。設(shè)計特異性引物從pCMV-beta質(zhì)粒中擴(kuò)增出報告基因LacZ,大小為4062 bp。將pMD19T-TKR質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ、EcoRⅠ雙酶切后,亞克隆至pcDNA3.1真核表達(dá)載體,構(gòu)建pcDNA3.1-TKR質(zhì)粒,其大小為6334 bp。之后,再將pMD19T-TKL質(zhì)粒經(jīng)NheⅠ-HindⅢ雙酶切后,亞克隆至pcDNA3.1-TKR質(zhì)粒載體中,構(gòu)建pcDNA3.1-TKL-TKR質(zhì)粒,其大小為7400 bp。最后,將報告基因LacZ的擴(kuò)增產(chǎn)物,通過HindⅢ酶切后,克隆至pcDNA3.1-TKL-TKR質(zhì)粒載體中,構(gòu)建pcDNA3.1-TKL-LacZ-TKR質(zhì)粒,該質(zhì)粒測序鑒定結(jié)果表明大小為11462 bp,與預(yù)期結(jié)果相符。
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.65
【圖文】：

圖 1-1 PRV 粒子結(jié)構(gòu)圖Fig.1-1 Structure of PRV virion (Pomeranz et al., 2005) 基因組結(jié)構(gòu) 基因組為雙股線狀 DNA（圖 1-2），大小約 150 kb，GC 含量高達(dá)00 多種蛋白質(zhì)。PRV 由長獨特區(qū)（UL 區(qū)域）、短獨特區(qū)（US 區(qū)重復(fù)序列（IRs 區(qū)域）、US 區(qū)段兩側(cè)末端重復(fù)序列（TRs 區(qū)域）四PRV 基因組含有至少 70 個基因，其中超 35 種基因是病毒復(fù)制非RV 的毒力主要由 gD、gE、gI 和 TK 基因協(xié)同控制（范偉興等，20

3圖 1-2 PRV 基因組結(jié)構(gòu)（Barbara et al., 2004）Figure 1-2 PRV genome structure1.4 病毒的理化特性和培養(yǎng)特性PRV 是皰疹病毒中抵抗力最高的，其對普通消毒劑不敏感，而對脂溶劑（、乙醚、酒精等）、X 射線、紫外線和甲醛等敏感，呈幾何級數(shù)滅活，胰蛋和某些酶類也能將其滅活，0.5%～1.0%NaOH 可很快將病毒滅活，但混在豬苗中不能被殺死。此外，pH 能影響 PRV 的活性，其在過酸或過堿的環(huán)境下

A:正常 Vero 細(xì)胞；B:接毒 12 h 的 Vero 細(xì)胞；C:接毒 24 h 的 Vero 細(xì)胞的 Vero；D:接毒 36 h的 Vero 細(xì)胞圖 2-1 Vero 細(xì)胞接種病毒所產(chǎn)生的 CPEFigure 2-1 CPE produced by Vero cell inoculation3.2 病毒核酸鑒定當(dāng)細(xì)胞病變達(dá) 70%~80%時收毒，反復(fù)凍融三次細(xì)胞培養(yǎng)液，提取病毒核酸，用 PRV gD（305 bp）特異性引物進(jìn)行 PCR 檢測，電泳檢測擴(kuò)增出約 305 bp 的特異性條帶，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序證明系 PRV gD 基因的部分序列（圖 2-2）。

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