【摘要】：山羊腹瀉是山羊以拉稀為主要臨床癥狀的一類疾病的總稱,7日齡以內(nèi)的羔羊表現(xiàn)最為嚴(yán)重,多種因素可以引起山羊腹瀉,其中細(xì)菌性腹瀉最常見,主要病原菌有產(chǎn)腸毒素大腸桿菌、沙門菌、志賀菌和奇異變形桿菌等。以上單一病原菌可以引起山羊腹瀉,但常見多種病原菌混合感染。對(duì)引起山羊腹瀉的重要病原菌盡早做出準(zhǔn)確檢測(cè),并采取有效的預(yù)防和治療措施是控制本病的關(guān)鍵。本研究首先建立同時(shí)檢測(cè)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌、沙門菌、志賀菌和奇異變形桿菌這4種病原菌的多重PCR方法,并用該方法對(duì)從四川部分地區(qū)采集的山羊肛拭子樣本進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)分離鑒定4種病原菌,研究分離菌的耐藥性,為山羊細(xì)菌性腹瀉的藥物防治提供參考;研究山羊源志賀菌的主要生物學(xué)特性,豐富其病原學(xué)研究資料。研究結(jié)果如下:(1)山羊腹瀉4種病原菌多重PCR方法的建立及應(yīng)用本研究針對(duì)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC)K99基因,沙門菌invA基因,志賀菌侵襲性質(zhì)粒H ipaH基因和奇異變形桿菌ureR基因設(shè)計(jì)4對(duì)特異性引物,通過引物濃度和退火溫度的優(yōu)化,確定最佳引物濃度、退火溫度、反應(yīng)體系和反應(yīng)條件,通過特異性、敏感性和重復(fù)性評(píng)價(jià),建立同時(shí)檢測(cè)引起山羊腹瀉的4種主要病原菌的多重PCR方法,并應(yīng)用該方法檢測(cè)山羊糞便樣品。結(jié)果顯示多重PCR擴(kuò)增目的條帶大小與預(yù)期片段大小相符;對(duì)魏氏梭菌等6種腸道細(xì)菌均無擴(kuò)增,表明該方法特異性好;該方法對(duì)ETEC、沙門菌、奇異變形桿菌和志賀菌檢測(cè)的敏感性分別為10~3 CFU/mL、10~2 CFU/mL、10~2 CFU/mL和10~3 CFU/mL;該方法穩(wěn)定性和重復(fù)性好;應(yīng)用建立的多重PCR方法對(duì)21份山羊腹瀉臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果與細(xì)菌分離鑒定結(jié)果一致,無漏檢。本研究建立了特異、靈敏和重復(fù)性好的檢測(cè)山羊腹瀉4種病原菌的多重PCR方法,為山羊腹瀉4種病原菌的快速檢測(cè)提供了可靠的檢測(cè)手段。(2)山羊腹瀉4種病原菌的多重PCR檢測(cè)、分離鑒定及耐藥性檢測(cè)本研究采用已建立的多重PCR方法對(duì)158份山羊腹瀉肛拭子和68份健康肛拭子提取的DNA進(jìn)行檢測(cè),并對(duì)多重PCR檢測(cè)陽性的樣本進(jìn)行4種病原菌的分離鑒定,同時(shí)分析分離菌株對(duì)18種常用抗菌藥物的敏感性。結(jié)果ETEC、沙門菌、志賀菌和奇異變形桿菌在158份腹瀉樣本中的多重PCR檢出率分別為69.6%(110/158)、21.5%(34/158)、41.8%(66/158)、17.8%(28/158);在68份健康樣本中的檢出率分別為22.0%(15/68)、11.7%(8/68)、0%(0/68)、11.7%(8/68)。細(xì)菌分離鑒定結(jié)果顯示,158份腹瀉樣本中,ETEC分離率為58.8%(93/158),沙門菌分離率為15.2%(24/158),志賀菌分離率為34.2%(54/158),奇異變形桿菌分離率為11.0%(17/158);68份健康樣本中,ETEC分離率為16.1%(11/68),沙門菌分離率為11.7%(8/68),奇異變形桿菌分離率為8.8%(6/68),健康樣本中沒有分離到志賀菌。腹瀉樣本中4種病原菌的PCR檢出率和分離率都高于健康樣本,其中腹瀉樣本的ETEC和志賀菌多重PCR檢出率和分離率極顯著高于健康樣本,由此可以推斷ETEC和志賀菌是引起四川部分地區(qū)山羊細(xì)菌性腹瀉最主要的病原菌。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明,4種病原菌對(duì)18種常用抗生素耐藥性都十分嚴(yán)重,最多為14重耐藥,4種病原菌僅對(duì)頭孢噻肟、大觀霉素、丁胺卡那、頭孢拉定4種抗生素共同高度敏感,4種病原菌對(duì)其余14種抗菌藥物呈不同程度的耐藥。(3)山羊源志賀菌的血清型鑒定、毒力基因檢測(cè)及其對(duì)小鼠的致病性對(duì)分離鑒定的54株山羊源志賀菌進(jìn)行血清學(xué)分型;PCR檢測(cè)其攜帶的,sat、sen、setA、pic、sigA、icsP、ial、iusA、iutA、ipaH共10個(gè)毒力基因的情況;對(duì)攜帶毒力基因最多的優(yōu)勢(shì)血清型菌株采用灌胃法檢測(cè)其對(duì)BALB/c小鼠的致病性。結(jié)果54株山羊源志賀菌均為福氏志賀菌,其中4株為福氏1 a血清型,11株為福氏1 b血清型,28株血清型為福氏2 b血清型,11株血清型為福氏3 b血清型,其中福氏2 b血清型為優(yōu)勢(shì)血清型。54株志賀菌均100%攜帶sat、sen、ipaH基因,而setA、pic、sigA、icsP、ial、iusA、iutA基因的攜帶率分別為73.6%、65.2%、65.2%、77.8%、82.0%、79.1%、79.1%;54株山羊源志賀菌中,最少攜帶4個(gè),最多攜帶所有檢測(cè)的10個(gè)毒力基因。攜帶10個(gè)毒力基因的4株福氏志賀菌2b優(yōu)勢(shì)血清型菌株均在1.7×10~8 CFU/mL灌胃劑量下致死全部試驗(yàn)小鼠,其中福氏志賀菌SWUN553對(duì)BALB/c小鼠灌胃的LD_(50)為1.04×10~6 CFU。福氏志賀菌SWUN553致死小鼠的組織病理學(xué)顯示試驗(yàn)小鼠心、肝、脾、肺、結(jié)腸出現(xiàn)明顯的壞死與炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病變,回腸的粘膜下層有輕微的炎性細(xì)胞浸潤(rùn),腸道中結(jié)腸病變最為嚴(yán)重,提示結(jié)腸為該菌入侵的最可能部位。
【學(xué)位授予單位】：西南民族大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.61
【圖文】：

圖 2-1 四種病原菌單一 PCR 特異性擴(kuò)增結(jié)果Fig.2-1 The specific amplification for 4 pathogenic brke DL2000；1：奇異變形桿菌單一 PCR；2：沙門菌單大腸桿菌單一 PCR；4：志賀菌單一 PCR；N：陰DNAMarker; 1: Single PCR product of proteusmirabilis; ; 3: Single PCR product of E.coli; 4: Single PCR product ocontrol病原菌目的基因擴(kuò)增的目的條帶回收、轉(zhuǎn)化、克沙門菌、奇異變形桿菌、志賀菌目的基因的擴(kuò)同源性均達(dá) 99 %以上，表明 PCR 產(chǎn)物確為各目菌提取陽性質(zhì)粒模板單一 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 2%瓊期產(chǎn)物大小相符。

多重PCR引物濃度優(yōu)化結(jié)果

最佳退火溫度（圖 2-3）。圖 2-2 多重 PCR 引物濃度優(yōu)化結(jié)果Fig.2-2 Optimization results for the primers concentrations ofthe qA Marke DL2000；1～9：K99 最佳引物濃度 500 nmol/L ipaH，度為(500,450,400,350,300,250,200,150,100 nmol/L)；N：陰000 DNA Marker; 1～9: K99 concentration of primer 500 nmol/L,intration of primer(500,450,400,350,300,250,200,150,100 nmol/L)；

【參考文獻(xiàn)】

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1 李靜;項(xiàng)琪;;羊腹瀉的病因、癥狀及防治[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2015年08期

2 王晶晶;夏賓雁;岳華;湯承;;四川省部分地區(qū)山羊沙門氏菌健康帶菌率及耐藥性調(diào)查[J];中國畜牧獸醫(yī);2015年02期

3 郇娟;戈紅雨;張成龍;韓雙羽;師偉;王玉寶;;雙重PCR檢測(cè)沙門氏菌和變形桿菌方法的建立[J];天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2015年01期

4 陳曦;王遠(yuǎn)微;王永;湯承;;山羊腹瀉糞便中奇異變形桿菌的分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析[J];中國畜牧獸醫(yī);2014年08期

5 徐義剛;李丹丹;劉忠梅;吳巖;李蘇龍;魏冬旭;;應(yīng)用DPO-PCR方法特異性檢測(cè)志賀氏菌[J];中國畜牧獸醫(yī);2014年03期

6 曲澤慧;陳佩佩;張愛芹;郭東春;林歡;姜騫;劉家森;師東方;曲連東;;產(chǎn)腸毒素大腸桿菌雙重PCR檢測(cè)方法的建立[J];中國畜牧獸醫(yī);2013年07期

7 陶立;李軍;藍(lán)顯利;陸以全;計(jì)安華;潘宗康;陳澤祥;楊威;;廣西圈養(yǎng)山羊主要細(xì)菌性疾病調(diào)查[J];畜牧與獸醫(yī);2011年10期

8 王R

本文編號(hào)：2760391