【摘要】：均衡的日糧蛋白和氨基酸不僅有利于豬的生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖,也可以提高飼料效率和減少對(duì)環(huán)境的污染。氨基酸通過激活mTORC1信號(hào)通路來影響蛋白質(zhì)的合成,氨基酸不能自由通過細(xì)胞膜,需要細(xì)胞膜上氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的協(xié)助才能完成轉(zhuǎn)運(yùn)。溶酶體膜是mTORC1被氨基酸激活的場(chǎng)所,其上的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體SLC38A9和SLC36A1除了轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸外,還以氨基酸感應(yīng)復(fù)合體來感應(yīng)氨基酸并激活mTORC1信號(hào)通路。本研究旨在確定低蛋白日糧對(duì)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體和mTORC1信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)量的影響,闡明SLC38A9和SLC36A1感應(yīng)氨基酸和調(diào)節(jié)mTORC1信號(hào)通路的機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:1.利用定量PCR芯片等技術(shù)分析在低蛋白日糧處理下,氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體和mTORC1信號(hào)通路相關(guān)基因在豬背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)量變化。結(jié)果顯示,飼喂25 d和45 d時(shí),與20%粗蛋白(標(biāo)準(zhǔn)水平)日糧相比,降低3%粗蛋白并保證賴氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸和色氨酸的含量不變,氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)量、背最長(zhǎng)肌的重量以及mTOR和S6K1的磷酸化水平均沒有差異變化。飼喂25 d時(shí),與20%和17%粗蛋白日糧組相比,14%粗蛋白日糧組的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體SLC38A2、SLC1A7、SLC7A5、SLC16A10和SLC3A2表達(dá)量顯著(P0.05)升高,并且在聚類分析中聚為一類,mTOR和S6K1的磷酸化水平和背最長(zhǎng)肌重量降低。低濃度氨基酸培養(yǎng)基處理分化成肌管的C2C12細(xì)胞,氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體SLC7A1、SLC7A5、SLC3A2、SLC38A2和SLC36A1的mRNA水平表達(dá)量升高,mTOR和S6K1的磷酸化水平下降。表明適當(dāng)降低日糧蛋白水平(降低少于3%)不影響氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)與背最長(zhǎng)肌的蛋白合成和重量,但是日糧蛋白水平過低(降低超過3%)和缺乏氨基酸促進(jìn)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá),抑制mTORC1的活性導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成受阻和背最長(zhǎng)肌重量下降,從而影響豬的生長(zhǎng)性能。2.構(gòu)建SLC38A9和SLC36A1超表達(dá)載體并合成干擾片段,利用QPCR、免疫熒光和免疫共沉淀等技術(shù)分析SLC38A9和SLC36A1的相互作用,以及對(duì)mTOR定位溶酶體膜和磷酸化水平的影響。結(jié)果表明在正常狀態(tài)下,SLC38A9和SLC36A1相互結(jié)合和相互影響對(duì)方的表達(dá)和定位,并且從溶酶體膜上釋放失活的mTOR至細(xì)胞質(zhì)并促進(jìn)mTORC1信號(hào)通路的活性;缺乏氨基酸時(shí),SLC38A9和SLC36A1的表達(dá)量升高,但SLC38A9和SLC36A1的結(jié)合能力減弱,此時(shí)mTOR從溶酶體膜移動(dòng)至細(xì)胞質(zhì),活性被抑制;添加亮氨酸后,SLC38A9和SLC36A1的表達(dá)量升高,兩者的結(jié)合能力增強(qiáng),此時(shí)mTOR從細(xì)胞質(zhì)定位到溶酶體膜并被激活。利用免疫共沉淀和LC-MS/MS分析得到與SLC38A9相互作用的蛋白,KEGG通路分析表明這些蛋白主要參與到與氨基酸感應(yīng)和蛋白質(zhì)合成相關(guān)通路中,比如mTOR信號(hào)通路、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)加工和AMPK信號(hào)通路。3.利用雙熒光素酶試驗(yàn)和ChIP-PCR得出豬SLC38A9啟動(dòng)子區(qū)域存在兩個(gè)AARE并且都與ATF4結(jié)合,第一內(nèi)含子處的AARE位于SLC38A9的核心啟動(dòng)子區(qū)域。構(gòu)建ATF4超表達(dá)載體并合成干擾片段,QPCR結(jié)果顯示ATF4在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控SLC38A9的表達(dá)。在缺乏氨基酸處理下,ATF4的表達(dá)量下降而SLC38A9的表達(dá)量上升,添加亮氨酸時(shí)兩者的表達(dá)量均上升。表明在缺乏氨基酸的條件下mTORC1被抑制導(dǎo)致其下游ATF4的表達(dá)和蛋白質(zhì)合成下降,而ATF4與SLC38A9上的AARE的結(jié)合增強(qiáng),進(jìn)而使SLC38A9的表達(dá)量上升;添加亮氨酸后,mTORC1信號(hào)通路被激活,蛋白合成增加,ATF4被激活后促進(jìn)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá),SLC38A9的表達(dá)量升高進(jìn)一步促進(jìn)mTORC1信號(hào)通路的活性。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S816
【圖文】：

華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2019 屆博士研究生學(xué)位（畢業(yè)）論文化合物的形式排出。日糧中的蛋白質(zhì)含量過低不利于豬的生長(zhǎng)和發(fā)育，蛋白質(zhì)含量過高不能被吸收，形成氨氣污染空氣，變成糞便污染河流(Milgen and Dourmad 2015,Wu 2014)。 根據(jù)飼料的高成本和環(huán)境因素，調(diào)整日糧中蛋白質(zhì)和氨基酸含量，提高豬飼料效率從而得到優(yōu)化和可持續(xù)發(fā)展的豬肉生產(chǎn)系統(tǒng)是非常有意義的。

蛋白質(zhì)合成(Deng et al 2009, Duan et al 2016, Li et al 2017, Liu et al 2015)、能量代Li et al 2017)、脂肪沉積(Duan et al 2016, Fan et al 2017, Jiao et al 2016, Li et al 20opes et al 2017, Madeira et al 2013)、腸道微生物群(Fan et al 2017, Qiu et al 2017)、合物排放(Li et al 2015, Liu et al 2017)和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)(Li et al 2017)等，在低日糧中添加氨基酸可以改善低蛋白帶來的一些負(fù)面作用(Che et al 2017, Deng e009, Jiao et al 2016, Li et al 2015, Li et al 2017, Madeira et al 2014, Otto et al 20eng et al 2016)（表 1-1）。研究表明信號(hào)通路參與低蛋白日糧影響豬營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝制 IGF-1/mTOR 通路可抑制蛋白質(zhì)的合成，激活 FOXO1/MAFbx/MuRF1 通路促白質(zhì)降解，AMPKα 通路可影響能量代謝(Li et al 2017)（圖 1-2）。低蛋白日糧通TOR 通路抑制蛋白質(zhì)合成的關(guān)鍵是氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，機(jī)體對(duì)于氨基酸水平的適應(yīng)性反應(yīng)主要表現(xiàn)在氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)量的變化(Humphrey et al 2004)。在氨基酸的情況下，越來越多的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體被報(bào)道參與到 mTORC1 信號(hào)通路中同調(diào)節(jié)肌肉蛋白質(zhì)的合成(Liu et al 2017, Liu et al 2016)。

mTOR參與mRNA翻譯Fig.1-3mTORregulatesmRNAtranslation

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2759901