【摘要】：雞傳染性貧血(chicken infectious anemia,CIA)又稱藍(lán)翅病、出血性綜合征和貧血性皮炎綜合征等,是由圓環(huán)病毒科雞傳染性貧血病毒(CIAV)引起的以雛雞再生障礙性貧血和全身性淋巴組織萎縮為主要特征的免疫抑制病。CIAV在MSB1細(xì)胞中病毒滴度較低,而通過雞胚傳代獲得的病毒量也不高,使CIA滅活疫苗的生產(chǎn)成本很高,難以在養(yǎng)雞業(yè)大量推廣應(yīng)用。CIAV活疫苗由于存在安全風(fēng)險(xiǎn),也未推廣應(yīng)用。故近年來,基因工程疫苗研制已成為CIAV研究的重點(diǎn)領(lǐng)域之一。為探索制備雞傳染性貧血病毒重組蛋白亞單位疫苗的可行性,本研究利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)對(duì)雞傳染性貧血病毒VP1、VP2基因進(jìn)行了克隆表達(dá),構(gòu)建三組重組轉(zhuǎn)移載體:p Fast Bac HTA-VP1及p Fast Bac HTA-VP2;p Fast Bac HTA-VP1-IRES-VP2;p Fast Bac Dual-VP1-VP2,將它們分別轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞得到相應(yīng)的重組表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Sf21獲得含有VP1、VP2基因的重組桿狀病毒v Bac-VP1、v Bac-VP2、v Bac-VP1-IRES-VP2、v Bac-VP1-VP2,利用三組重組桿狀病毒分別感染懸浮培養(yǎng)的Sf21細(xì)胞表達(dá)重組蛋白,即v Bac-VP1與v Bac-VP2共感染Sf21細(xì)胞、v Bac-VP1-IRES-VP2和v Bac-VP1-VP2分別獨(dú)立感染Sf21細(xì)胞。SDS-PAGE及Western-blot結(jié)果證明,VP1、VP2基因在昆蟲細(xì)胞中得到了表達(dá)。將重組蛋白制備油乳劑滅活苗免疫SPF雞進(jìn)行蛋白免疫原性研究,動(dòng)物試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí),重組蛋白免疫SPF雞可產(chǎn)生高滴度的ELISA抗體,提示重組桿狀病毒表達(dá)的VP1、VP2蛋白具有良好的免疫原性,其中,v Bac-VP1與v Bac-VP2共感染Sf21細(xì)胞和v Bac-VP1-IRES-VP2獨(dú)立感染Sf21細(xì)胞所表達(dá)蛋白的免疫效果接近,而v Bac-VP1-VP2感染細(xì)胞所表達(dá)蛋白的免疫效果最佳。本研究為CIAV亞單位疫苗的開發(fā)奠定了良好的基礎(chǔ),具有較好的應(yīng)用前景。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.65
【圖文】：

監(jiān)察所碩士學(xué)位論文 而 VP2 是 VP1 的輔助蛋白，能幫助 VP1 形成正確的構(gòu)象，二者相互協(xié)調(diào)才護(hù)作用[16]。據(jù)國(guó)內(nèi)外學(xué)者報(bào)道，單獨(dú)表達(dá)的 VP1 蛋白抗體反應(yīng)較弱[17]，共同表有確實(shí)的免疫原性[18]。VP3 蛋白被命名為 Apoptin（凋亡素）[19]，研究表明， pRSV-VP3 轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的雞單核細(xì)胞，可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生類似于 CIAV 感染明 VP3 的表達(dá)引發(fā)了 CIAV 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程[20]。

圖2-1 VP1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果 圖2-2 VP2基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果1:VP1基因擴(kuò)增產(chǎn)物；M:MarkerⅣ 1:VP2基因擴(kuò)增產(chǎn)物；M:MarkerⅣ2.3.2 IRES 序列的克隆以本實(shí)驗(yàn)室保存的 pMD18-T-IRES 質(zhì)粒為模板，以 IRES-F、IRES-R 為引物擴(kuò)增 IRES 片段，增產(chǎn)物經(jīng) 0.8％瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)得到了約 612 bp 的特異片段，與預(yù)計(jì)的目的片段大小一致（2-3）。bp

圖2-1 VP1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果 圖2-2 VP2基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果1:VP1基因擴(kuò)增產(chǎn)物；M:MarkerⅣ 1:VP2基因擴(kuò)增產(chǎn)物；M:MarkerⅣ2.3.2 IRES 序列的克隆以本實(shí)驗(yàn)室保存的 pMD18-T-IRES 質(zhì)粒為模板，以 IRES-F、IRES-R 為引物擴(kuò)增 IRES 片段，增產(chǎn)物經(jīng) 0.8％瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)得到了約 612 bp 的特異片段，與預(yù)計(jì)的目的片段大小一致（2-3）。bp

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