【摘要】：貓皰疹病毒I型(Feline herpesvirus-1,FHV-1)是貓傳染性鼻氣管炎的病原體,可引起貓科動(dòng)物急性、高度接觸性上呼吸道疾病。FHV-1屬于皰疹病毒科,甲型皰疹病毒亞科成員,為雙股DNA病毒。FHV-1隱性感染和感染后康復(fù)的貓能長(zhǎng)期帶毒和排毒,成為傳染源。同其他皰疹病毒一樣,FHV-1可潛伏在貓的三叉神經(jīng)節(jié),并在貓免疫力低下時(shí)再激活而導(dǎo)致發(fā)病,給該病的防控造成困難。因此,加強(qiáng)對(duì)國(guó)內(nèi)FHV-1流行毒株的分離鑒定及診斷方法的建立對(duì)該病的防控具有重要意義。本研究首先從病貓眼鼻拭子中分離病毒,進(jìn)行一系列鑒定。結(jié)果表明該分離株可在CRFK細(xì)胞上產(chǎn)生典型CPE,病毒滴度可達(dá)到10~8 TCID_(50)/mL。電鏡下觀察到圓形、有囊膜、直徑大小約150 nm的病毒顆粒。提取病毒基因組,擴(kuò)增gD基因,得到一條1125 bp大小的特異性條帶,經(jīng)測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)其與標(biāo)準(zhǔn)毒株FHV-1 C-27 gD基因序列相似性達(dá)100%,表明該分離株為FHV-1,命名為HR-1。IFA結(jié)果顯示接種HR-1的CRFK細(xì)胞出現(xiàn)特異性熒光。動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果顯示,HR-1感染家貓后,臨床主要表現(xiàn)為眼結(jié)膜炎和鼻氣管炎;病理切片發(fā)現(xiàn)肺臟上皮細(xì)胞組織增生,腎小管上皮細(xì)胞空泡化、壞死等;利用Real-time qPCR方法,能從感染貓的眼、鼻拭子中檢測(cè)到病毒核酸,且在感染后第4-6天病毒載量達(dá)到最高峰,同時(shí)證明HR-1在三叉神經(jīng)中可以復(fù)制。HR-1對(duì)家貓的致死率可達(dá)100%,表明HR-1對(duì)家貓有較強(qiáng)的致病性。其次,選取高度保守且免疫原性好的gD糖蛋白為研究對(duì)象,利用TMHMM Server v.2.0和BepiPred 1.0 server在線軟件預(yù)測(cè)gD蛋白的跨膜區(qū)及抗原表位富集區(qū),確定了從505 bp-987 bp為gD抗原表位富集區(qū),該片段長(zhǎng)483 bp;克隆表達(dá)gD抗原表位富集區(qū),制備了重組gD-483蛋白,經(jīng)SDS-PAGE、Western blot分析,gD-483蛋白具有良好的抗原性且為可溶性表達(dá)。將其作為包被抗原,建立FHV-1抗體間接ELISA診斷方法。結(jié)果顯示gD-483重組蛋白的最佳包被濃度為2ng/μL,時(shí)間為37°C 2 h;待檢血清最佳稀釋度為1:400,作用時(shí)間為37°C 45 min;二抗最佳稀釋度為1:8000,作用時(shí)間為37°C 45 min;底物最佳顯色時(shí)間為37°C 5 min。確定陰陽(yáng)性血清的臨界值為0.432;與FCV、FPV、FIPV-1、FIPV-2陽(yáng)性血清均無交叉反應(yīng),具有良好的特異性;組內(nèi)、組間變異系數(shù)均小于10%,重復(fù)性良好;FHV-1的陽(yáng)性血清稀釋至1:3200仍顯示為陽(yáng)性,敏感性好;與IFA比對(duì)試驗(yàn)符合率92%。利用建立的間接ELISA方法檢測(cè)100份貓血清樣品,抗體陽(yáng)性率為77%。本研究分離并鑒定了一株國(guó)內(nèi)FHV-1 HR-1,對(duì)其進(jìn)行致病性分析,可為貓傳染性鼻氣管炎疫苗的評(píng)價(jià)提供效力檢驗(yàn)用強(qiáng)毒;以gD重組蛋白為包被抗原建立的間接ELISA診斷方法,操作簡(jiǎn)便,可為FHV-1感染的防控奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.65
【圖文】：

科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第二章 FHV-1分離鑒定及致-1 毒株感染動(dòng)物后，在感染六天麻醉動(dòng)物并處死。取材部位為三叉神經(jīng)節(jié)、肺臟氣管，同時(shí)取對(duì)照組動(dòng)物相同的組織。取材的動(dòng)物組織除三叉神經(jīng)節(jié)外各樣品分液氮速凍后置于-80 °C 保存，待提取組織核酸，進(jìn)行熒光定量檢測(cè)，另一份置于固定；對(duì)因 HR-1 感染死亡的動(dòng)物，取材部位為三叉神經(jīng)節(jié)，肺臟、氣管、腎臟并做同樣處理，最后將固定的組織樣品送至哈爾濱獸醫(yī)研究所病理切片室進(jìn)行切進(jìn)行觀察分析。果病毒分離純化及 TCID50測(cè)定采集的拭子樣品處理后接種 CRFK 單層細(xì)胞 3 d 后出現(xiàn)明顯的 CPE，可見細(xì)胞聚后細(xì)胞逐漸脫落（如圖 2.1）。將病毒在 CRFK 細(xì)胞中通過蝕斑純化 3 代，將純胞后測(cè)定其滴度為 108TCID50/mL。

（如圖 2.1）。將病毒在 CRFK 細(xì)胞中通過蝕 108TCID50/mL。A:感染組 CRFK 細(xì)胞 B：對(duì)照組 CRFK 細(xì)圖 2.1 拭子接種 CRFK 細(xì)胞Fig 2.1 CRFK cell inoculated with swabs培養(yǎng)物上清進(jìn)行電鏡負(fù)染觀察，病毒粒子外約為 150 nm（見圖 2.2）

M：DL2000 DNA Marker；1：gD；2：陰性對(duì)照?qǐng)D 2.3 gD 基因的 PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.2.3 Amplication of gD gene by PCRFK 細(xì)胞 48 h 后，以 FHV-1 陽(yáng)性血清作為一抗，以 結(jié)果顯示，病毒感染的細(xì)胞單層中出現(xiàn)特異性綠色染 HR-1 的 CRFK 細(xì)胞; B:陰性對(duì)照?qǐng)D 2.4 HR-1 病毒 IFA 鑒定結(jié)果B

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 張繼一;劉寶山;趙玉軍;;貓皰疹病毒1型gD基因的表達(dá)[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2009年11期

2 虎俊隆;皰疹病毒與神經(jīng)節(jié)[J];固原師專學(xué)報(bào);2004年06期

3 李明,逄愛慧;人皰疹病毒與牙周病的研究進(jìn)展[J];臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志;2003年08期

4 ;鵝皰疹病毒[J];中國(guó)家禽;2001年18期

5 ;瑞士同性戀人群中有8型人皰疹病毒的高度流行[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè));1999年02期

6 劉世珍;;國(guó)立衛(wèi)生研究院發(fā)現(xiàn)了新的類皰疹病毒[J];生物技術(shù)通報(bào);1987年06期

7 李淑之,龐廣仁,周全,王印其;葡萄球菌蛋白A對(duì)單皰病毒性角膜炎快速診斷的初步應(yīng)用[J];眼科研究;1988年01期

8 王福忠,那立新,楊明久;免疫核糖核酸轉(zhuǎn)移抗皰疹病毒免疫活性的研究[J];中國(guó)免疫學(xué)雜志;1988年04期

9 管澤民;錢芳;;單純皰疹病毒與口腔科疾病[J];口腔醫(yī)學(xué)縱橫;1988年02期

10 李思經(jīng);;法國(guó)Institut Merieux公司計(jì)劃臨床試驗(yàn)皰疹病毒[J];生物技術(shù)通報(bào);1989年07期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 劉寶山;張繼一;;貓皰疹病毒1型糖蛋白研究進(jìn)展[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜傳染病學(xué)分會(huì)第七屆全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)暨第十三次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集（上冊(cè)）[C];2009年

2 蔡銘升;程安春;汪銘書;;動(dòng)物皰疹病毒基因工程疫苗的研究進(jìn)展[A];第四屆第九次全國(guó)學(xué)術(shù)研討會(huì)暨飼料和動(dòng)物源食品安全戰(zhàn)略論壇論文集（下冊(cè)）[C];2008年

3 章麗嬌;李占鴻;李爽;張清水;孫海港;白如念;楊秀環(huán);胡薛英;蘇敬良;;鴿皰疹病毒于我國(guó)的首次分離與鑒定[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)2014年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2014年

4 李玉峰;史玉穎;馬秀麗;吳靜;于可響;林樹乾;黃兵;;禽皰疹病毒特有基因序列同源性分析[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)禽病學(xué)分會(huì)第十四次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2008年

5 劉超;邱亞峰;馬志永;;α-皰疹病毒與宿主細(xì)胞骨架相互作用的研究進(jìn)展[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)獸醫(yī)公共衛(wèi)生學(xué)分會(huì)第二次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2010年

6 田志軍;仇華吉;童光志;;一種豬皰疹病毒的分離與鑒定[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物傳染病學(xué)分會(huì)第十二次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2007年

7 鄭之北;吳亦棟;尚世強(qiáng);杜立中;;兒科常見人皰疹病毒的檢測(cè)及基因分型[A];2007年浙江省兒科學(xué)、小兒外科學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2007年

8 周榮;劉文寬;曾文鋌;劉倩;許元生;;皰疹病毒是引起“自疑陰滋病人”癥狀的病原體嗎?[A];新發(fā)和再發(fā)傳染病防治熱點(diǎn)研討會(huì)論文集[C];2011年

9 鄭樹城;王慶;Sven M.Bergmann;李瑩瑩;曾偉偉;王英英;劉春;石存斌;;華南地區(qū)錦鯉鯉皰疹病毒3型潛伏感染初步調(diào)查[A];2016年中國(guó)水產(chǎn)學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2016年

10 黃瑜;蘇敬良;王春鳳;程龍飛;李文楊;彭春香;莊向生;郭玉璞;;鴨2型皰疹病毒的分子生物學(xué)依據(jù)[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)2003年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2003年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 本報(bào)記者 吳昊;“不明怪病”硝煙未盡[N];科學(xué)時(shí)報(bào);2011年

2 記者 何德功;鯉魚皰疹病毒在日本大面積感染[N];新華每日電訊;2003年

3 束梅英;皰疹病毒：癌細(xì)胞的克星[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2001年

4 記者 操秀英;皰疹病毒組裝機(jī)制揭示[N];科技日?qǐng)?bào);2018年

5 新華;英國(guó)研究用皰疹病毒治腦癌[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2000年

6 高潔;皰疹病毒易感染哪些部位[N];醫(yī)藥養(yǎng)生保健報(bào);2009年

7 記者 楊保國(guó) 通訊員 姚瓊;皰疹病毒基因組包裝關(guān)鍵機(jī)制被揭示[N];中國(guó)科學(xué)報(bào);2019年

8 記者 徐靖;中科大揭示皰疹病毒基因組包裝關(guān)鍵機(jī)制[N];人民日?qǐng)?bào);2019年

9 武漢協(xié)和醫(yī)院皮膚性病科 馮愛平;慎防皰疹病毒侵襲胎兒[N];家庭醫(yī)生報(bào);2005年

10 健苗;鯉皰疹病毒疫苗有待改進(jìn)[N];中國(guó)漁業(yè)報(bào);2016年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 齊眉;人皰疹病毒8型重組蛋白的制備和應(yīng)用及其感染的流行病學(xué)調(diào)查[D];山東大學(xué);2006年

2 王賽賽;基于DIP病毒的腫瘤相關(guān)γ皰疹病毒—宿主拮抗機(jī)制研究[D];浙江大學(xué);2016年

3 張貴和;脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活及其細(xì)胞因子在帶狀皰疹后神經(jīng)痛形成中的作用[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2011年

4 秦宇;干擾素調(diào)節(jié)因子7對(duì)人類8型皰疹病毒基因表達(dá)的影響[D];天津醫(yī)科大學(xué);2009年

5 任偉成;櫛孔扇貝急性病毒性壞死病毒基因組全序列的測(cè)定和核酸診斷技術(shù)的研究[D];中國(guó)海洋大學(xué);2009年

6 王星;新疆人類8型皰疹病毒的致病機(jī)制研究及在獻(xiàn)血者中流行病學(xué)調(diào)查[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2009年

7 王好;鯉皰疹病毒3型實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的建立及囊膜蛋白108的表達(dá)免疫研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

8 鄭雪燕;蝙蝠直腸標(biāo)本攜帶病毒的調(diào)查[D];南方醫(yī)科大學(xué);2016年

9 關(guān)澤紅;CDK2在皰疹病毒復(fù)制中作用的研究[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2008年

10 李安;豬偽狂犬病病毒gD蛋白與受體Nectin-1相互作用的研究[D];廣西大學(xué);2017年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 劉曉曉;貓皰疹病毒HR-1毒株的分離鑒定及其間接ELISA方法的建立[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2019年

2 沈兆媛;鯉皰疹病毒Ⅱ型單克隆抗體檢測(cè)方法的建立與中草藥防控效果研究[D];上海海洋大學(xué);2018年

3 白銀榮;利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建表達(dá)EGFP的兩株重組火雞皰疹病毒rHVT-US2/US10-EGFP[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

4 李航;貓皰疹病毒Ⅰ型gI基因序列分析及PCR檢測(cè)方法的建立[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

5 譚湘芳;腎移植患者人皰疹病毒6型和7型與巨細(xì)胞病毒感染相關(guān)性研究[D];南華大學(xué);2007年

6 羅丹;鯉皰疹病毒Ⅱ型4種檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

7 史杰;基于長(zhǎng)片段PCR擴(kuò)增的貝類皰疹病毒全基因組高通量測(cè)序及變異分析[D];上海海洋大學(xué);2017年

8 夏俊洋;牡蠣皰疹病毒魁蚶株基因組測(cè)定與分析[D];中國(guó)海洋大學(xué);2015年

9 郭穎;鴿皰疹病毒全基因克隆及DNA疫苗的制備[D];東北林業(yè)大學(xué);2017年

10 黃燕琳;逆行性牙髓炎與人皰疹病毒的相關(guān)性研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2013年

本文編號(hào)：2758966