【摘要】：瘋草(Locoweed)是含有生物堿苦馬豆素(swainsonine,SW)的豆科棘豆屬和黃芪屬有毒植物的統(tǒng)稱,廣泛分布于美國、中國、加拿大等國家。動物過量采食會發(fā)生瘋草中毒病,造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。鏈格孢屬波狀芽管孢組(Alternaria Sect.Undifilum spp)瘋草內(nèi)生真菌可產(chǎn)生SW,與瘋草毒性緊密相關(guān)。研究該類真菌合成SW的路徑和調(diào)控機(jī)理,可為從生物控制角度降低或消除瘋草的毒性奠定基礎(chǔ)。但該類真菌合成SW的機(jī)理仍未闡明,目前僅發(fā)現(xiàn)酵母氨酸還原酶基因參與瘋草內(nèi)生真菌中SW合成的調(diào)控,其SW合成機(jī)理可能與豆類絲核菌和金龜子綠僵菌相似。直立黃芪(Astragalus adsurgens Pall)在中國被作為人工牧草廣泛種植,該植物病原真菌Alternariagansuense與瘋草內(nèi)生真菌形態(tài)相似,遺傳進(jìn)化關(guān)系緊密,但該真菌是否產(chǎn)生SW仍未見報(bào)道。本研究對直立黃芪中產(chǎn)SW真菌進(jìn)行分離和鑒定,為進(jìn)一步闡明該真菌與直立黃芪、瘋草內(nèi)生真菌的關(guān)系,及直立黃芪的安全利用提供依據(jù)。LAAO可能參與L-賴氨酸降解,KS基因可能參與SW合成過程的調(diào)控,但這些基因在瘋草內(nèi)生真菌中的具體功能仍未確定,本研究對來自直立黃芪和不同種瘋草產(chǎn)SW真菌的LAAO、KS基因進(jìn)行檢測和分析,為進(jìn)一步確定其功能提供依據(jù)。本研究還對經(jīng)UV、EMS和NTG誘變處理的瘋草內(nèi)生真菌菌株進(jìn)行了篩選,篩選SW合成與對照株差異顯著且產(chǎn)率穩(wěn)定的突變菌株,為進(jìn)一步篩選瘋草內(nèi)生真菌中與SW合成相關(guān)的差異表達(dá)基因提供菌種材料。本研究的主要內(nèi)容如下:1.對直立黃芪植物組織中的真菌進(jìn)行分離,檢測各分離菌株菌絲中是否含有SW。對產(chǎn)SW菌株ITS、GPD和KS等序列進(jìn)行測定和遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果表明,從直立黃芪中共分離到43株真菌,其中13株含有SW,但其SW含量僅為0.004±0.046mg·g-1,顯著低于瘋草內(nèi)生真菌的SW含量。該13株真菌與己報(bào)道的直立黃芪病原真菌甘肅鏈格孢(Alternaria gansuense)和產(chǎn)SW瘋草內(nèi)生真菌(Alternaria Section Undifilum sp)的親緣關(guān)系最近,根據(jù)形態(tài)特征和遺傳進(jìn)化分析結(jié)果,將其劃分到鏈格孢屬波狀芽管孢組中,并命名為甘肅波狀芽管孢(Alternaria Section Undifilum gansuense)。2.對從直立黃芪和黃花棘豆、變異黃芪、冰川棘豆、莖直黃芪等4種瘋草中分離的13株產(chǎn)SW菌株LAAO和KS基因進(jìn)行檢測、序列測定和一致性比較。結(jié)果表明,該類真菌LAAO片段長度均為798 bp,KS的片段長度為690 bp或691 bp。12株來自瘋草的波狀芽管孢內(nèi)生真菌的LAAO序列完全一致,但從直立黃芪分離出的甘肅波狀芽管孢在6個(gè)核苷酸位點(diǎn)發(fā)生了突變。與已報(bào)道的產(chǎn)SW瘋草內(nèi)生真菌Alternaria Section U.oxytropis(KY365741)相比,13株產(chǎn)SW菌株的KS序列在0～11個(gè)核苷酸位點(diǎn)發(fā)生了突變,導(dǎo)致0～9個(gè)氨基酸殘基發(fā)生突變。其中甘肅波狀芽管孢突變的所有位點(diǎn)與其他瘋草內(nèi)生真菌完全不同。LAAO基因可能參與L-賴氨酸的合成或從L-賴氨酸到L-哌可酸合成途徑的調(diào)控,KS基因可能參與從L-哌可酸到SW合成途徑的調(diào)控,不同菌株KS基因核苷酸位點(diǎn)的突變可能與該基因的表達(dá)和SW合成調(diào)控相關(guān)。3.對UV、EMS和NTG誘變初篩獲得的SW產(chǎn)率發(fā)生顯著變化的26株候選突變菌株連續(xù)傳代培養(yǎng)3代,對各菌株的SW產(chǎn)率進(jìn)行檢測和統(tǒng)計(jì)分析,篩選SW合成與對照株差異顯著且穩(wěn)定的突變菌株。結(jié)果表明,三次篩選共獲得E-02,E-25,E-23 3株SW合成與對照株產(chǎn)率差異顯著(p0.05)且保持穩(wěn)定的突變菌株,其中E-02菌株在連續(xù)傳代培養(yǎng)后,SW產(chǎn)率與對照株差異極顯著(p0.01)。該研究可為進(jìn)一步對瘋草內(nèi)生真菌進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析提供菌株。
【學(xué)位授予單位】：寧夏大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S859.8
【圖文】：

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本文編號：2758642