【摘要】：弓形蟲(Toxoplasma gondii)為專性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲可以感染包括人類在內(nèi)的所有溫血?jiǎng)游?呈全球性分布。弓形蟲病作為人獸共患病主要通過食用含有活組織包囊的肉類,或攝入含有卵囊的食物或水而被感染。近年來,弓形蟲病在養(yǎng)殖業(yè)中傳播廣泛,尤其是豬,可造成妊娠母豬流產(chǎn)或產(chǎn)死胎,嚴(yán)重危害公共健康及畜牧業(yè)的發(fā)展,而目前仍無有效預(yù)防弓形蟲病的措施。因此,尋找理想的、有效的抑制弓形蟲感染的方法已迫在眉睫。目前研究表明,在小鼠抗弓形蟲感染的細(xì)胞免疫中,干擾素能夠誘導(dǎo)大量內(nèi)源性天然免疫蛋白的表達(dá)并發(fā)揮抵抗弓形蟲感染的作用,其中包含免疫相關(guān)GTP酶(Immunity-related GTPase,IRG)和鳥苷酸結(jié)合蛋白(GBPs)。IRGs在結(jié)構(gòu)和功能上分為GMS(免疫相關(guān)GTP酶家族M)蛋白和GKS(免疫相關(guān)GTP酶家族K)蛋白,GMS類IRG(Irgm1、Irgm2、Irgm3)通過missing-self的原理,“引導(dǎo)”GKS類IRG(Irga6、Irgb6、Irgb10等)募集到納蟲空泡膜(Parasitophorous vacuole membrane,PVM)表面,并引起GBPs的聚集,形成“攻膜復(fù)合體結(jié)構(gòu)”,進(jìn)而使得PVM發(fā)生囊泡化,暴露出其內(nèi)的弓形蟲,使得弓形蟲被宿主細(xì)胞內(nèi)的天然免疫分子識(shí)別,繼而殺滅弓形蟲。而在人類細(xì)胞中,IRGM蛋白可以通過自噬系統(tǒng)對(duì)入侵的內(nèi)源性病原體進(jìn)行殺傷。但研究表明人類細(xì)胞中GBPs不能被募集到PVM表面發(fā)揮抗寄生蟲作用,由此推測(cè)是否在進(jìn)化過程中,GBPs在抗弓形蟲感染免疫過程中功能消減。從進(jìn)化角度分析犬的親緣關(guān)系與人較近,那么是否與小鼠相比犬中抗弓形蟲感染的免疫機(jī)制與人的更為接近呢?因此本研究首先利用慢病毒包裝的方法檢測(cè)IRG_S與GBPs蛋白在野生型細(xì)胞的定位檢測(cè)情況。通過與小鼠Irgm1、Irgm2、Irgm3序列比對(duì)分析找到犬源Irgm4,Irgm5,Irgm6蛋白,并設(shè)計(jì)特異性正向和反向guide RNA(gRNA),利用CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)對(duì)犬MDCK細(xì)胞中的Irgm4,Irgm5,Irgm6進(jìn)行逐一敲除,并采用PCR擴(kuò)增及測(cè)序的方法進(jìn)行驗(yàn)證,建立Irgm~(4/5/6-/-)基因敲除細(xì)胞系。其次在IFN-γ誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)的情況下,比較分析野生型犬腎細(xì)胞(MDCK)、Irgm~(4/5/6-/-)基因敲除細(xì)胞系及Irgm~(4/5/6)基因補(bǔ)回細(xì)胞中弓形蟲生長狀況。研究結(jié)果顯示,在IFN-γ未誘導(dǎo)的情況下,弓形蟲生長差異不顯著;而在IFN-γ誘導(dǎo)的情況下,Irgm~(4/5/6-/-)基因敲除細(xì)胞與野生型MDCK細(xì)胞相比弓形蟲生長速度顯著升高,表明犬細(xì)胞中Irgms為IFN-γ誘導(dǎo)型基因并發(fā)揮抗弓形蟲生長的作用。第三,為了進(jìn)一步探究犬細(xì)胞中Irgms抑制弓形蟲生長的協(xié)同作用蛋白,利用激光共聚焦的方法檢測(cè)相關(guān)蛋白與弓形蟲PVM的定位情況,研究表明Irgb11與Irgb12被募集到弓形蟲PVM的表面發(fā)揮抗弓形蟲的作用,其中Irgb12發(fā)揮主導(dǎo)作用,而GBP1和GBP5并沒有被募集到PVM的表面,說明在犬細(xì)胞中GBPs并不能通過破壞PVM的方式抑制弓形蟲生長這與人源GBPs功能相似。本研究首次對(duì)犬MDCK細(xì)胞中的Irgm4,Irgm5,Irgm6進(jìn)行逐一敲除,驗(yàn)證了Irgm~(4/5/6-/-)基因敲除細(xì)胞抗弓形蟲生長作用。結(jié)果表明在犬MDCK細(xì)胞中,利用CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)驗(yàn)證了經(jīng)IFN-γ誘導(dǎo)下Irgm4、Irgm5、Irgm6具有發(fā)揮抑制弓形蟲生長的功能,Irgms蛋白能誘導(dǎo)Irgbs蛋白募集到弓形蟲PVM的表面形成類似“攻膜復(fù)合體”的結(jié)構(gòu)破壞PVM從而發(fā)揮抗弓形蟲生長的作用。本研究為今后深入研究宿主抗弓形蟲感染的天然免疫機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S855.9
【圖文】：

圖 3-1 GFP 基因的 PCR 擴(kuò)增A 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1-4: GFP 目的片ig. 3-1 PCR amplification of GFP ge: DL2 000 DNA Marker; 1-4: GFPge

31 Irgb11 與 Irgb12 基因的 PCR 擴(kuò)增子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1: Irgb11；2:Irgb12 amplification of Irgb11 and Irgb12 genes000 DNAMarker; 1: Irgb11; 2:Irgb12圖 3-3 GBP1 與 GBP5 基因的M: DNA 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1: GBP1Fig. 3-3 PCR amplification of GBP1M: DL2 000 DNA Marker; 1: GB

31 Irgb11 與 Irgb12 基因的 PCR 擴(kuò)增子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1: Irgb11；2:Irgb12 amplification of Irgb11 and Irgb12 genes000 DNAMarker; 1: Irgb11; 2:Irgb12圖 3-3 GBP1 與 GBP5 基因的M: DNA 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1: GBP1Fig. 3-3 PCR amplification of GBP1M: DL2 000 DNA Marker; 1: GB

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本文編號(hào)：2758144