【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)是嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的病原。PRRSV的非糖基化M蛋白是最保守的結(jié)構(gòu)蛋白,在病毒粒子中M蛋白和GP5以二硫鍵相連形成的異源二聚體是PRRSV感染必須的。本研究通過(guò)制備M蛋白單克隆抗體,鑒定其識(shí)別的表位,篩選與M蛋白相互作用的宿主細(xì)胞蛋白,進(jìn)一步分析M蛋白與宿主細(xì)胞蛋白NF45的相互作用及其對(duì)PRRSV復(fù)制的影響,以期為揭示M蛋白在PRRSV感染與免疫中的生物學(xué)功能提供科學(xué)依據(jù)。 用超速離心純化的PRRSV HuN4-F112免疫6周齡BALB/c雌性小鼠,取脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合。利用間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞,經(jīng)亞克隆獲得2株分泌抗PRRSV M蛋白單克隆抗體(MAb)的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為1C8和3F7,其IFA效價(jià)均能達(dá)到1：512。亞類鑒定結(jié)果表明,1C8和3F7分別為IgG2a和IgG1亞類。Westernblot分析顯示,2株單抗均能與PRRSV M蛋白特異性結(jié)合。阻斷ELISA分析表明,1C8和3F7與PRRSV的反應(yīng)能被PRRSV陽(yáng)性血清阻斷。 利用制備的2株M蛋白單克隆抗體,對(duì)M蛋白進(jìn)行了抗原表位的鑒定。首先將M蛋白截短為相互重疊的4段,進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果顯示,單克隆抗體1C8識(shí)別MF1(aa1-55),單克隆抗體3F7識(shí)別MF4(aa121-174);進(jìn)一步對(duì)這兩段分別截短為8段,最后經(jīng)寡核苷酸直接退火連接到表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá),結(jié)果顯示1C8識(shí)別M蛋白的aa3-6(3SSLD6),3F7識(shí)別M蛋白的aal55-163(155VLGGRKAVK163)。研究結(jié)果表明,單克隆抗體1C8和3F7識(shí)別的表位為首次確認(rèn)的M蛋白線性表位。氨基酸序列比對(duì)顯示,鑒定的2個(gè)表位在基因2型毒株中高度保守,而在基因1型毒株中存在缺失和突變。 利用M蛋白單克隆抗體,采用免疫共沉淀(Co-IP)結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)方法,篩選與PRRSV M蛋白相互作用的宿主細(xì)胞蛋白,并對(duì)篩選出的細(xì)胞蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,PRRSV HuN4-F112感染組共存在10條差異表達(dá)的蛋白條帶,將10條蛋白膠條帶進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析,鑒定出285個(gè)(UniquePepCount≥2)與M蛋白相互作用的宿主蛋白,這些蛋白主要與蛋白翻譯、病原致病、信號(hào)傳導(dǎo)等細(xì)胞通路存在密切的關(guān)系。 將分別攜帶HuN4-F112-M和NF45的真核表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,利用免疫共沉淀和激光共聚焦技術(shù)驗(yàn)證了PRRSV M蛋白與宿主細(xì)胞蛋白NF45的相互作用和共定位情況。將PRRSV HuN4-F112感染MARC-145細(xì)胞,利用M蛋白單克隆抗體3F7進(jìn)行免疫共沉淀,在免疫復(fù)合物中也能檢測(cè)到NF45蛋白,表明M蛋白和NF45蛋白在病毒感染情況下也具有相互作用。利用siRNA沉默MARC-145細(xì)胞中NF45基因的表達(dá)后,再感染PRRSV,采用Western blot和病毒滴度測(cè)定分析NF45對(duì)PRRSV增殖的影響。結(jié)果表明,抑制NF45的表達(dá)能降低子代病毒的產(chǎn)量和病毒M蛋白的表達(dá),提示宿主細(xì)胞蛋白NF45參與PRRSV的復(fù)制。 綜上所述,本研究鑒定出存在于PRRSV M蛋白的2個(gè)新表位aa3-6和aa155-163,篩選出與PRRSV M蛋白互作的宿主細(xì)胞蛋白,并繪制出蛋白互作圖譜,證實(shí)了PRRSV M蛋白與宿主細(xì)胞蛋白NF45具有相互作用,并揭示了NF45在PRRSV增殖中的生物學(xué)意義。研究結(jié)果豐富了M蛋白的抗原結(jié)構(gòu),并為深入研究M蛋白與宿主細(xì)胞蛋白相互作用的分子機(jī)制及其生物學(xué)意義提供了重要依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.65
【圖文】：

別基W 2別HP-PRRSV HuN4及疫苗株HuN4-Fl丨2、JXA1-R、TJM-F92,而不能識(shí)別基閃1嘲VP046 BIS和DV株（圖2-1A) , 3F7單抗能夠識(shí)別基因2R%HP-PRRSV HuN4.疫苗株HiiN4-Fl 12、JXA1-R, TJM-F92 和基網(wǎng) 1 型 VP046 BIS,而不能識(shí)別基閃 1 型 DV 株（圖 2-2B)。2.3.3雜交瘤細(xì)胞的染色體鑒定經(jīng)秋水仙素法檢測(cè)，SP2/0細(xì)胞的平均染色體數(shù)為55-65，BALB/C小鼠脾細(xì)胞的染色體數(shù)為40，而彡々交瘤細(xì)胞的平均染色體數(shù)為95-105。結(jié)果證實(shí)，獲得的彡j!；交瘤細(xì)胞為融合所得（閣2-3)。14

特性的鑒定盒對(duì)單克隆抗體的I類和輕鏈耶進(jìn)行了鑒定。結(jié)果顯示類，輕鏈均為K鏈C表2-丨）。表2-1單克隆抗體的類型鑒定Table 2-1 Identification of MAbs subclass and subtypesIgG2a IgG2b IgG3 IgA IgM 0.254 0.059 0.08 0.057 0.058 0.054 0.054 0.053 0.054 0.055 分析單克隆抗體的特異性4-F112接種MARC-145細(xì)胞，并設(shè)細(xì)胞對(duì)照，48 h時(shí)收CA測(cè)細(xì)胞總蛋白濃度，將相同的蛋內(nèi)tt進(jìn)行SDS-PAG、GP3單抗和制備的2株M蛋內(nèi)單克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)。特異性地識(shí)別HLiN4-F112的M蛋白（圖2-4)。lluN4-FII2 - +

圖3-1 0RF6及其截短片段的PCR擴(kuò)增Fig. 3-1 PCR-amplifled products of PRRSV ORF6 and truncated segments3.3.2各基因片段原核表達(dá)載體的單、雙酶切及PCR鑒定

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

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本文編號(hào)：2757370