【摘要】：大腸桿菌作為一種畜禽常見的腸道菌群,在廣泛和持續(xù)的抗生素壓力下能夠形成細(xì)菌生物被膜來抵御外部生活環(huán)境的改變。隨著超級耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)和多重耐藥菌的數(shù)量增加,國內(nèi)外許多研究者將目光轉(zhuǎn)向新型抗菌藥物的研制和開發(fā),以期應(yīng)對日益嚴(yán)重細(xì)菌耐藥性問題,而植物藥物和益生菌是其中比較活躍的新領(lǐng)域。因此,本研究選用四種藏獸藥(華麗龍膽和巖生忍冬、偏翅唐松草、馬蹄黃)和兩株屎腸球菌(S16和S17)與常用抗生素進(jìn)行聯(lián)合藥敏試驗,探討其對藏豬和藏雞源大腸桿菌抗菌活性,以期為新型抗菌藥物的開發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。方法:(1)采用常規(guī)方法對203份采自藏豬和藏雞的糞便、尿液、雞蛋及其周圍的土壤和水體樣本進(jìn)行大腸桿菌分離和鑒定。(2)采用改良結(jié)晶紫半定量法和微量肉湯稀釋法分別對分離的大腸桿菌進(jìn)行生物被膜形成能力分析和12種常用抗菌藥物藥物敏感性試驗。(3)以篩選到的10株強(qiáng)生物被膜形成能力和多重耐藥大腸桿菌為研究對象,采用聯(lián)合藥敏試驗方法評價四種藏獸藥(馬蹄黃、偏翅唐松草、華麗龍膽和巖生忍冬)不同提取成分和屎腸球菌細(xì)菌素與高耐藥率抗生素對其聯(lián)合殺菌活性,并篩選其呈協(xié)同性的藥物組合。(4)以E6株為研究對象,采用快速銀染法觀察其胞外多糖的相對多少驗證其生物被膜形成能力,探討篩選的藥物組合對其生物被膜清除作用。結(jié)果:(1)從203份樣本中共分離到大腸桿菌152株,其中藏豬源大腸桿菌63株,雞源大腸桿菌84株,環(huán)境土壤源大腸桿菌1株,豬尿源大腸桿菌2株,雞蛋源大腸桿菌2株,大腸桿菌總分離率為74.88%。(2)152株分離菌株主要集中于中等成膜能力和無成膜能力兩個表型,OD_(570)比值處于1和4之間;用WHONET 5.6軟件分析結(jié)果表明,152株分離菌株對氯霉素、磺胺二甲基嘧啶、土霉素、氨芐西林、磺胺甲VA唑的耐藥率均高于90%,其中氨芐西林的耐藥率高達(dá)100%;對二氟沙星、環(huán)丙沙星、阿米卡星、頭胞噻呋、妥布霉素和頭胞曲松的耐藥率均低于50%,其中阿米卡星的敏感率最高,耐藥率僅為19.90%;152株分離菌株分布較為分散,一共存在48種耐藥譜型,其中12重耐藥的菌株有12株,占7.89%,11耐的18株,占11.84%,6耐以上的菌株共有134株,共占93.41%。(3)四種藏獸藥(馬蹄黃、偏翅唐松草、華麗龍膽和巖生忍冬)對大腸桿菌抑菌效果較強(qiáng)成分和益生菌乙酸乙酯提取物與大腸桿菌高耐藥率四種抗生素(氯霉素、土霉素、氨芐西林和磺胺甲VA唑)進(jìn)行聯(lián)合試驗。試驗結(jié)果表明:馬蹄黃甲醇提取物對大腸桿菌的MIC范圍處于3.93~15.63 mg/mL之間,與氯霉素、土霉素呈累加作用;與氨芐西林、磺胺甲VA唑呈無關(guān)作用;偏翅唐松草乙酸乙酯提取物對大腸桿菌的MIC范圍處于3.93~31.52 mg/mL之間,與氯霉素呈協(xié)同作用,與土霉素呈、氨芐西林、磺胺甲VA唑呈累加作用;華麗龍膽甲醇提取物對大腸桿菌的MIC范圍處于7.81~15.63 mg/mL之間,與氯霉素、土霉素和氨芐西林呈無關(guān)作用,與磺胺甲VA唑呈拮抗作用;巖生忍冬乙酸乙酯提取物對大腸桿菌的MIC范圍處于7.81~31.52 mg/mL之間,與氯霉素呈累加作用,與土霉素和氨芐西林呈協(xié)同作用,與磺胺甲VA唑呈無關(guān)作用。屎腸球菌S16乙酸乙酯提取物大腸桿菌的MIC范圍處于0.45~3.63 mg/mL之間,與氯霉素和磺胺甲VA唑呈無關(guān)作用,與土霉素和氨芐西林呈協(xié)同作用;屎腸球菌S17乙酸乙酯提取物大腸桿菌的MIC范圍處于0.42~13.38 mg/mL之間,與氯霉素呈無關(guān)作用,與土霉素呈協(xié)同作用;與磺胺甲VA唑和氨芐西林呈相加作用。華麗龍膽甲醇提取物與兩株屎腸球菌乙酸乙酯提取物呈累加作用;巖生忍冬乙酸乙酯提取物與屎腸球菌S17乙酸乙酯提取物呈協(xié)同作用,與屎腸球菌S16乙酸乙酯提取物呈累加作用;偏翅唐松草乙酸乙酯提取物與與兩株屎腸球菌乙酸乙酯提取物均呈累加作用;馬蹄黃甲醇提取物與屎腸球菌S16乙酸乙酯提取物呈無關(guān)作用,與屎腸球菌S17乙酸乙酯提取物呈累加作用。(4)E6株快速銀染法表明其胞外多糖的分泌量較多,具有很強(qiáng)的生物被膜形成能力,四種藏獸藥(馬蹄黃、偏翅唐松草、華麗龍膽和巖生忍冬)不同提取成分對E6生物被膜的抑制率與藥物濃度呈正相關(guān)。在MIC濃度下,巖生忍冬乙酸乙酯提取物與土霉素和氨芐西林聯(lián)合應(yīng)用對E6生物被膜的抑制率分別為48.92%和48.58%;偏翅唐松草乙酸乙酯提取物與土霉素和氨芐西林聯(lián)合應(yīng)用對E6生物被膜的抑制率分別為42.58%和47.84%,比單藥的抑制率有顯著性增強(qiáng),證明了兩者的聯(lián)用功效。在MIC濃度下,屎腸球菌S16乙酸乙酯提取物與土霉素和氨芐西林聯(lián)合應(yīng)用對E6生物被膜的抑制率分別為41.53%和33.88%;屎腸球菌S17乙酸乙酯提取物與土霉素和氨芐西林聯(lián)合應(yīng)用對E6生物被膜的抑制率分別為32.37%和34.26%,比單藥的抑制率有顯著性增強(qiáng),也證明了益生菌對抗生素的協(xié)同作用。巖生忍冬乙酸乙酯提取物與屎腸球菌S16和S17乙酸乙酯提取物聯(lián)合應(yīng)用對E6生物被膜的抑制率分別為37.33%和34.51%;偏翅唐松草乙酸乙酯提取物與屎腸球菌S16和S17乙酸乙酯提取物聯(lián)合應(yīng)用對E6生物被膜的抑制率分別為33.50%和35.61%,與單藥的抑制率相比有顯著性增強(qiáng),再次證明兩者聯(lián)用對成熟生物被膜呈協(xié)同作用。
【學(xué)位授予單位】：西南民族大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S859.7
【圖文】：

A B圖 4 大腸桿菌 E6 生物被膜銀染結(jié)果注：A：空白對照；B：E6 銀染圖ure 4 The results of silver staining of Escherichia coli E6 biofilmote: A: Negative control; B: silver staining of Escherichia coli E6 E6 生物被膜的抑制率藥敏試驗結(jié)果篩選出兩種藏獸藥（巖生忍冬、偏翅唐松草）、兩種西林、土霉素）、兩株屎腸球菌乙酸乙酯提取物。了 6 種藥物單用對大腸桿菌生物被膜的抑制率結(jié)果。從表中可見生跟所選藥物的濃度呈正相關(guān)。藥物在達(dá)到 1/4 MIC 濃度時，反而導(dǎo)增強(qiáng)。

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本文編號：2756390