【摘要】：綿羊是一種重要的經(jīng)濟(jì)動物,利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)能快速定向選育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的綿羊新品種。然而傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)克隆成功率低,獲得的轉(zhuǎn)基因個(gè)體常存在發(fā)育障礙�；谂咛ジ杉�(xì)胞(embryonic stem cell,ESC)的基因打靶技術(shù)能有效提高獲得轉(zhuǎn)基因小鼠的效率,但迄今為止,真正的綿羊的ESC很難獲得。利用轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)導(dǎo)綿羊體細(xì)胞建立綿羊的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(sheep induced pluripotent stem cell,si PSC)能代替ESC進(jìn)行基因打靶制備基因修飾綿羊,但目前制備si PSC尚處于起步階段,誘導(dǎo)效率非常低。因此,尋找一種高效快速誘導(dǎo)si PSC的方法十分迫切。si PSC的獲得不僅能用于轉(zhuǎn)基因綿羊的制備,還能為綿羊ESC的培養(yǎng)摸索條件,為探究體細(xì)胞重編程機(jī)制奠定基礎(chǔ);此外,si PSC在定向分化生殖細(xì)胞等功能細(xì)胞方面也具有廣泛的應(yīng)用前景。目的:(1)分離三種綿羊體細(xì)胞以尋找最佳誘導(dǎo)si PSC的起始細(xì)胞,并制備培養(yǎng)si PSC的飼養(yǎng)層細(xì)胞;(2)構(gòu)建p53干擾慢病毒質(zhì)粒以提高綿羊體細(xì)胞重編程的效率;(3)構(gòu)建ASF1A過表達(dá)的慢病毒質(zhì)粒以提高體綿羊細(xì)胞重編程的效率;(4)高效誘導(dǎo)綿羊體細(xì)胞為si PSCs;方法:(1)組織塊法分離培養(yǎng)妊娠45 d左右的中國美利奴綿羊胎兒成纖維細(xì)胞(sheep embryonic fibroblast,SEF)和腎細(xì)胞(sheep kidney cell,SKC),全骨髓法分離培養(yǎng)綿羊胎兒骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC);胰酶消化法分離孕12.5 d的CF-1小鼠胎兒成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblast,MEF),X-射線輻照處理P3代的MEF后凍存,用于培養(yǎng)si PSC;(2)根據(jù)Gen Bank數(shù)據(jù)庫中綿羊p53基因的序列,設(shè)計(jì)干擾p53的短發(fā)夾RNA(sh RNA),并克隆至慢病毒干擾載體p Lenti Lox 3.7(p LL3.7),構(gòu)建干擾綿羊p53基因的慢病毒干擾載體p LL3.7-p53-sh RNA。使用無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒p LL3.7-p53-sh RNA和p LL3.7空載體及輔助質(zhì)粒(VSVG、p MDL和REV)后在HEK-293FT細(xì)胞中包裝慢病毒并測定滴度,以慢病毒MOI=10感染SKC后,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測p53干擾效率,進(jìn)而篩選干擾效率高的干擾片段用于進(jìn)一步的si PSC誘導(dǎo);同時(shí),使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測p21蛋白的表達(dá)情況;(3)根據(jù)Gen Bank數(shù)據(jù)庫中綠色熒光蛋白EGFP和綿羊ASF1A基因序列,設(shè)計(jì)擴(kuò)增EGFP和ASF1A基因的引物序列,分別以p EGFP-N1和綿羊c DNA為模板,擴(kuò)增EGFP和ASF1A基因,并依次克隆至慢病毒表達(dá)載體p LEX-MCS,構(gòu)建過表達(dá)ASF1A的慢病毒載體p LEX-ASF1A-EGFP,并包裝過表達(dá)ASF1A的慢病毒ASF1A-LV,使用慢病毒EGFP-LV作為陰性對照。于慢病毒感染SKC后不同時(shí)間段收集細(xì)胞,分別提取細(xì)胞總RNA和總蛋白,并將總RNA反轉(zhuǎn)錄成c DNA,使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測ASF1A轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達(dá)情況;(4)包裝8種誘導(dǎo)si PSC的慢病毒(Oct4/Sox2/c-Myc/Klf4/Lin28/Nanog/Sv40LT/h TERT),測定滴度后,分別以慢病毒MOI=10懸浮感染SEF、SKC和BMSC,感染23天后,利用堿性磷酸酶染色比較三種細(xì)胞的重編程效率;選擇重編程效率高的體細(xì)胞,比較添加p53-sh RNA和ASF1A對重編程效率的影響。所有獲得的si PSCs進(jìn)行AP染色、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、免疫熒光染色、甲基化測序分析、核型分析、擬胚體分化和畸胎瘤形成等方法進(jìn)行鑒定。結(jié)果:(1)成功分離SKC、SEF、BMSC及MEF;經(jīng)CD44抗體標(biāo)記鑒定綿羊BMSC陽性率為99.7%;成功制備飼養(yǎng)層細(xì)胞;(2)共設(shè)計(jì)靶向p53的干擾片段4條,并成功構(gòu)建慢病毒干擾載體;成功包裝p53干擾慢病毒p53-sh RNA-LV;使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot成功篩選干擾效率高的干擾片段p53-sh RNA-3;同時(shí),干擾p53慢病毒感染SKC后,p53及其下游靶基因p21 m RNA和蛋白的表達(dá)水平顯著性降低;(3)成功克隆EGFP和ASF1A基因,并成功構(gòu)建ASF1A過表達(dá)的慢病毒表達(dá)載體Plex-ASF1A-EGFP;成功包裝ASF1A過表達(dá)的慢病毒ASF1A-LV;ASF1A-LV感染SKC細(xì)胞后顯著性增加了ASF1A m RNA和蛋白表達(dá)水平;(4)成功利用8種si PSC誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)綿羊三種體細(xì)胞為si PSC,其中SKC的重編程效率顯著高于BMSC和SEF;過表達(dá)ASF1A和干擾p53能顯著性增加si PSC的形成效率;成功獲得si PSC 6株。結(jié)論:(1)成功分離和培養(yǎng)了三種綿羊體細(xì)胞,為后續(xù)建立高效的綿羊誘導(dǎo)多能干細(xì)胞提供了實(shí)驗(yàn)材料;成功制備飼養(yǎng)層細(xì)胞,為后續(xù)綿羊誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的培養(yǎng)提供干細(xì)胞培養(yǎng)所必需的營養(yǎng)因子;(2)成功篩選干擾效率高的干擾片段p53-sh RNA-3,并能顯著性降低SKC細(xì)胞中p53和p21蛋白的表達(dá)。(3)成功構(gòu)建的ASF1A過表達(dá)慢病毒能顯著增加ASF1A的表達(dá)。(4)成功制備了si PSCs;SKC更容易發(fā)生體細(xì)胞重編程,降低p53基因的表達(dá),增加ASF1A的表達(dá)能提高重編程綿羊體細(xì)胞的效率。
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S826

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2753067