【摘要】：單核巨噬細胞是動物機體中一類重要的免疫細胞,其發(fā)揮的吞噬細菌作用在病原菌入侵時發(fā)揮至關重要的作用。當動物的免疫細胞吞噬病原菌后可以激活多種免疫應答,隨后對侵入的病菌進行清除。Toll樣受體(Toll-like receptor)作為一類重要的模式識別受體,在不同種分子刺激下能夠引發(fā)機體對病原體的免疫反應。其中TLR4在單核巨噬細胞等多種免疫細胞中表達。通過識別包括沙門氏菌、大腸桿菌等革蘭氏陰性菌的細胞壁成分,激活下游多種信號通路并引發(fā)吞噬細菌、炎癥反應、氧化殺傷等多種免疫反應,對最終在動物機體清除病菌中發(fā)揮著重要的作用。動物單核巨噬細胞識別并吞噬病原菌是細胞發(fā)揮其天然免疫反應的首要過程,而TLR4恰好是識別這些革蘭氏陰性菌的最重要受體。Southern blot檢測目前被認為是權威的鑒定轉基因動物的方法。實驗中首先采用地高辛標記探針、化學發(fā)光檢測的Southern雜交技術,通過提取優(yōu)質的基因組DNA,嚴格控制酶切條件、純化探針、優(yōu)化轉膜及化學發(fā)光步驟等過程獲得信號強、背景低、重復性好的Southern雜交結果。此外轉基因陽性綿羊TLR4基因在mRNA水平及蛋白水平均得到了穩(wěn)定高表達。過表達TLR4轉基因綿羊單核巨噬細胞在TLR4配體LPS刺激下,其下游絲裂原活化蛋白激酶信號通路(mitogen-activated protein kinase,MAPK)及胞內磷脂酰肌醇激酶信號通路(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)在半小時內被迅速地強烈激活,同時與吞噬細菌密切相關的清道夫受體(scavenger receptors,SRs)表達量顯著升高。首先,通過對綿羊單核巨噬細胞感染沙門氏菌后,轉基因綿羊組(transgenic group,Tg)TLR4下游信號通路中吞噬相關基因mRNA水平(SR-A,CD36,Lox-1等)和蛋白磷酸化水平(p38,JNK,ERK,Akt)均顯著高于非轉基因綿羊組(non-transgenic,NTg)。進一步研究發(fā)現(xiàn),Tg組細胞吞噬、黏附細菌能力均顯著高于NTg組,同時參與細胞骨架變化運動的F-actin含量在30min時也顯著高于NTg組。隨后,通過siRNA干擾技術及添加TLR4特異抑制劑CLI-095后發(fā)現(xiàn),在抑制了 TLR4及TLR4信號轉導后,轉基因羊單核巨噬細胞的吞噬黏附細菌能力顯著降低。最后,為了進一步研究在綿羊單核巨噬細胞中依賴TLR4發(fā)生的吞噬細菌作用是由何種信號通路介導的,本研究中分別使用p38,JNK,ERK,PI3K特異性抑制劑抑制其信號轉導。最后發(fā)現(xiàn)MAPK信號通路及PI3K信號通路都參與到TLR4介導的吞噬細菌過程中。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)在綿羊單核巨噬細胞中TLR4通過影響MAPK、PI3K信號通路以及隨后激活的F-actin和清道夫受體調節(jié)細胞吞噬細菌功能。并發(fā)現(xiàn)過表達TLR4轉基因綿羊的單核巨噬細胞對沙門氏菌有更強的吞噬能力。本研究豐富了人們對綿羊中TLR4與吞噬細菌機制間聯(lián)系的認知,同時為轉基因抗病育種提供了重要的理論依據及全新的探索。
【學位授予單位】：中國農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S852.4
【圖文】：

圖１－１．邋Ｔｏｌｌ樣受體在巨噬細胞中的信號轉導［２４］逡逑Ｆｉｇ．邋１－１．邋ＴＬＲ邋ｓｉｇｎａｌｉｎｇ邋ｉｎ邋ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ逡逑１．１邋ＭｙＤ８８依賴信號通路逡逑ＴＬＲ，ＭＤ８８與白介素受體相關激酶（ＩＲＡＫ）形成復合物Ｍｙｄｄｏｓｏｍｅ邋［

１邋＃逡逑圖１－１．邋Ｔｏｌｌ樣受體在巨噬細胞中的信號轉導［２４］逡逑Ｆｉｇ．邋１－１．邋ＴＬＲ邋ｓｉｇｎａｌｉｎｇ邋ｉｎ邋ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ逡逑１．２．１．１邋ＭｙＤ８８依賴信號通路逡逑在ＴＬＲ的參與下，ＭｙＤ８８與白介素受體相關激酶（ＩＲＡＫ）形成復合物Ｍｙｄｄｏｓｏｍｅ邋［２５］？逡逑在Ｍｙｄｄｏｓｏｍｅ形成過程中，ＩＲＡＫ４激活ＩＲＡＫＩ，并在幾個位點［２６］進行自發(fā)發(fā)生a愃嶧笫頭佩義希停模福稿澹郟玻罰蕁＃桑遙粒耍捎耄裕遙粒疲督岷希孀牛裕遙粒疲隊敕核亓用福眨攏茫保澈停眨牛鄭粒保兩岷洗俳義希耍叮沉擁模裕遙粒疲逗停裕粒耍鋇鞍準っ父春銜鋃嗑鄯核鼗�。ＴＡＫ９P譴俜至言罨鞍準っ訃っ訃ゅ義廈福ǎ停粒校耍耍耍┘易逯械囊輝�，可以和碟X諮腔裕粒隆劍裕粒攏�，ＴＡn承緯篩春銜錚郟玻�，邋２９ＪnＫ溴義先唬裕粒耍蚣せ畹牡幕粕脅磺宄

本文編號：2752345