【摘要】：肌內(nèi)脂肪含量是影響牛肉品質(zhì)的重要因素。在肉牛育肥中,生產(chǎn)者希望獲得肌內(nèi)脂肪沉積豐富,飼料消耗少的牛只以獲得更高的利潤。因此,培育生長速度快,IMF含量高的肉牛品種具重要意義。肌內(nèi)脂肪是沉積在骨骼肌肌纖維和肌束間的脂肪組織。脂肪組織含量是由細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞體積決定的,其沉積與分布受到基因與營養(yǎng)因素的調(diào)控。為了探究肉牛肌內(nèi)脂肪發(fā)育的機(jī)理,本研究選取與牛肉質(zhì)性狀相關(guān)的基因S100A10和bta-miR-210作為研究對象,通過研究bta-miR-210和S100A10在體外成脂分化模型中的作用來初步解釋其對生長性狀的作用機(jī)制。以小鼠前體脂肪細(xì)胞為模型,通過轉(zhuǎn)染siRNA干擾細(xì)胞內(nèi)S100A10的表達(dá)來觀察對小鼠前體脂肪細(xì)胞向白色/棕色成脂分化的影響,以此為S100A10基因?qū)τ谌馀＜?nèi)脂肪沉積的研究提供科學(xué)依據(jù);bta-miR-210主要通過外源過表達(dá)和敲低靶基因來探究bta-miR-210對牛PDGFRα~+祖細(xì)胞成脂分化的影響。得到的主要結(jié)果如下:1、利用膠原酶消化法從12周齡小鼠腹股溝兩側(cè)的白色脂肪組織中分離前體脂肪細(xì)胞;利用膠原酶消化和細(xì)胞表面標(biāo)記分選結(jié)合從5月齡胎兒牛背最長肌組織中獲得PDGFRα~+祖細(xì)胞;2、小鼠前體脂肪細(xì)胞長滿后進(jìn)行白色/棕色成脂分化,同時用siRNA干擾S100A10基因的表達(dá),誘導(dǎo)分化6天時脂滴明顯變少;通過熒光定量PCR、蛋白免疫印跡和細(xì)胞免疫熒光觀察影響成脂分化的特異轉(zhuǎn)錄因子顯著下降;3、在胎兒牛PDGFRα~+祖細(xì)胞分化過程中通過定量檢測bta-miR-210的表達(dá)量上調(diào);4、過表達(dá)bta-miR-210,9天時觀察脂滴明顯變多;通過熒光定量PCR、蛋白免疫印跡檢測成脂分化的標(biāo)志性基因顯著上升;5、通過雙熒光素酶報告驗證WISP2為bta-miR-210的靶基因。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S823
【圖文】：

國內(nèi)外不少研究者對牛的重要經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行 GWAS，篩選到一部分與牛性狀相關(guān)的基(Zhang et al., 2016; Chen et al., 2015; Finlay et al., 2012)。Jahuey 等團(tuán)隊通過對夏洛萊牛進(jìn)行 GWA分析，篩選出與生長性狀相關(guān)的基因TRAF6、CDH11和KLF7等(Zhang et al., 2016; Chen et al., 20Finlay et al., 2012)。Cesar 等人通過 SNP 芯片對 386 頭內(nèi)洛爾閹割牛進(jìn)行基因分型，使用貝葉方法確定了可能與肌內(nèi)脂肪沉積和組成相關(guān)的基因組區(qū)域和候選基因(Cesar et al., 2014)。肉牛肥中，生產(chǎn)者希望獲得肌內(nèi)脂肪沉積豐富，飼料消耗少的牛只以獲得更高的利潤。中國農(nóng)業(yè)科院北京畜牧獸醫(yī)研究所牛遺傳育種創(chuàng)新團(tuán)隊本團(tuán)隊以 1 141 頭西門塔爾牛為材料，使用 Illumi770 K 高密度芯片分型數(shù)據(jù)對肉質(zhì)性狀進(jìn)行了 GWAS 研究，篩選到與大理石花紋評分性狀顯著關(guān)的候選基因 S100A10(Xia et al., 2016)。1.3 S100A10 研究現(xiàn)狀S100A10 是 S100 家族成員之一，調(diào)控靶蛋白對胞內(nèi) Ca2+作出應(yīng)答反應(yīng)。與 S100 家族的其成員相比，S100A10 對 Ca2+是不敏感的，因為與 Ca2+相連接的地方被氨基酸替代。在細(xì)胞內(nèi)S100A10 主要與外周膜結(jié)合蛋白 Annexin A2 結(jié)合成緊密的異四聚體復(fù)合物，具體的結(jié)合方式S100A10 二聚體與兩個 Annexin A2 相結(jié)合，有 2 種結(jié)合方式，見圖 1.1。

圖 1.2AnnexinA2-S100A10 參與的膜蛋白轉(zhuǎn)運(Rescherand Gerke, 2007)Fig 1.2 Membrane protein trafficking pathways with involvement ofAnnexin A2 S100A10.Reddy 等(Reddy et al., 2012)在小鼠和人乳腺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)當(dāng)沉默掉 S100A10 時，抑制了Annexin A2 與細(xì)胞膜的結(jié)合。目前，關(guān)于 S100A10 在脂肪代謝方面的研究鮮有報道。2017 年 Liu等(Liu et al., 2017)發(fā)現(xiàn)在人肝癌細(xì)胞中過表達(dá) S100A10，其與細(xì)胞質(zhì)中脂滴的位置一致；2016 年Ahmad 和 Alexes(Salameh et al., 2016)在小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，Annexin A2 與抗增殖蛋白(PHB)、脂肪酸轉(zhuǎn)運者(CD36)形成復(fù)合物參與脂肪組織中脂肪酸的跨膜轉(zhuǎn)運。本研究以 S100A10 基因可能調(diào)控肉牛肌內(nèi)脂肪沉積為出發(fā)點，采用小鼠白色前體脂肪細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化模型，通過敲低 S100A10基因并誘導(dǎo)其白色/棕色成脂分化來探究 S100A10 基因?qū)τ谇绑w脂肪細(xì)胞成脂分化的影響，進(jìn)而研究脂肪沉積和能量消耗兩個生物學(xué)過程中 S100A10 的功能。為進(jìn)一步研究 S100A10 基因?qū)τ谌馀＜?nèi)脂肪沉積的影響提供理論支持。1.4 miRNA 的研究進(jìn)展microRNA(簡稱 miRNA)是一類內(nèi)生的、長度約 21-25 個核苷酸的小 RNA，最早被發(fā)現(xiàn)于線蟲體內(nèi)(Lee et al., 1993)，隨后又被發(fā)現(xiàn)存在于植物、動物和一些病毒中，其在細(xì)胞內(nèi)具有多種重要的調(diào)節(jié)作用。最近的研究表明大約 70%的哺乳動物 miRNA 基因是位于 TUs 區(qū)(Transcription

農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 夠調(diào)節(jié)機(jī)體代謝，減少肥胖癥和糖尿病等一些代謝疾病的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，視黃酸、冷刺些激素等都可以引起 WAT 棕色化(Barbatelli et al., 2010b; Wang et al., 2017; Asano et al.,emic et al., 2017; Ohno et al., 2012)。WAT 棕色化可以增加胰島素敏感性，有研究證實可以食方面帶來的肥胖(Kim et al., 2016)；還可以改善葡萄糖的耐受量，在肥胖的小鼠體內(nèi)移植色脂肪細(xì)胞，可以明顯看到空腹小鼠的血糖下降，耐受量得到改善(Min et al., 2016)。本研00A10 基因可能調(diào)控肉牛肌內(nèi)脂肪沉積為出發(fā)點，采用小鼠白色前體脂肪細(xì)胞體外誘導(dǎo)分，通過敲低 S100A10 基因并誘導(dǎo)其白色/棕色成脂分化來探究 S100A10 基因?qū)τ谇绑w脂肪脂分化的影響，進(jìn)而研究脂肪沉積和能量消耗兩個生物學(xué)過程中 S100A10 的功能。.1 脂肪細(xì)胞的分化形成過程目前普遍認(rèn)為脂肪細(xì)胞是由于中胚層的 MSCs 逐漸分化而來，經(jīng)過分化至脂肪祖細(xì)胞、肪細(xì)胞，最終分化為成熟的脂肪細(xì)胞。細(xì)胞分化的過程受到一些轉(zhuǎn)錄因子和激素的作用，著一系列成脂基因的相互作用和時序性表達(dá)，見圖 1.3。細(xì)胞成脂分化過程大致可以分為段：定向前期、定向之后的生長期、生長抑制期、克隆擴(kuò)增期、終末分化期和脂滴積累期階段特點見表 1(Lefterova et al., 2009)。

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