發(fā)布時間：2020-07-12 05:35

【摘要】：1998年和2005年在中國爆發(fā)人感染豬鏈球菌的疾病引起了全世界對于豬鏈球菌(Streptococcus suis,S.suis)的關(guān)注。闡明該菌的致病機(jī)制以及病原與宿主之間的相互作用,對于預(yù)防和治療該疾病有重要的意義。本論文基于小鼠模型,揭示豬鏈球菌2型所致鏈球菌中毒樣休克綜合征(streptococcal toxic-shock-like syndrome,STSLS)與炎性小體、炎性因子“風(fēng)暴”之間的關(guān)系。1.炎性小體激活在豬鏈球菌誘導(dǎo)的STSLS中發(fā)揮作用2005年四川疫情爆發(fā)時分離的菌株豬鏈球菌2型SC-19感染小鼠,造成小鼠STSLS的發(fā)生,以高炎性因子“風(fēng)暴”、多組織損傷、高致死率為特征。而在感染中以caspase-1的抑制劑抑制炎性小體激活時,可以明顯緩解豬鏈球菌2型感染所致鏈球菌樣中毒樣休克綜合征的相關(guān)癥狀,提高小鼠的存活率。為了進(jìn)一步探究炎性小體在豬鏈球菌感染中扮演的角色,實驗中對炎性小體下游的信號通路進(jìn)行了阻斷,結(jié)果顯示阻斷IL-1β不能提高小鼠的存活率,而使用IL-18的抑制性抗體,可以緩解SC-19感染所引起的STSLS。證實,炎性小體的激活在豬鏈球菌感染所致的STSLS中發(fā)揮作用。2.NLRP3炎性小體激活促進(jìn)了豬鏈球菌誘導(dǎo)STSLS的發(fā)生為了證實豬鏈球菌能激活炎性小體,并探究其激活炎性小體的類型,我們在293T細(xì)胞中重構(gòu)了NLRP1b、NLRP3、NLRC4、AIM2四種主要類型的炎性小體,以MOI=10的SC-19感染細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn),SC-19主要激活NLRP3炎性小體。在人的THP1細(xì)胞和小鼠的J774a.1細(xì)胞中,利用CRISPR技術(shù)突變了nlrp3基因使NLRP3蛋白表達(dá)缺失。SC-19感染細(xì)胞后顯示SC-19只能激活野生型細(xì)胞而不能激活缺失NLRP3的細(xì)胞的炎性小體,證實SC-19激活了NLRP3炎性小體且這個過程依賴鉀離子外流。為了進(jìn)一步闡明炎性小體激活在豬鏈球菌所致的STSLS中的作用,在小鼠感染模型上使用了NLRP3炎性小體特異性的抑制劑MCC950,觀察MCC950是否能緩解SC-19引起的STSLS。結(jié)果發(fā)現(xiàn),使用MCC950能緩解STSLS的相關(guān)癥狀,包括炎癥因子的降低、多組織損傷程度降低、致死率的降低。以上結(jié)果說明,豬鏈球菌感染誘導(dǎo)NLRP3炎性小體的激活促進(jìn)了STSLS的發(fā)生。3.豬鏈球菌通過溶血素的溶血活性激活NLRP3炎性小體為了探究SC-19的何種組分激活了炎性小體,收集實驗室保存的不同豬鏈球菌突變體并構(gòu)建溶血素溶血活性突變體msly(P353L)。首先分別用活的和熱滅活的SC-19感染PMA分化THP1而來的巨噬細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)僅有活的細(xì)菌能刺激細(xì)胞炎性小體的激活。再用不同的突變體感染細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)只有溶血素相關(guān)突變株:溶血素缺失突變體、溶血素溶血活性突變體不能激活炎性小體。為了進(jìn)一步探究溶血素和炎性小體之間的關(guān)系,實驗使用了純化的重組溶血素蛋白直接刺激細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)溶血素能劑量依賴性激活炎性小體。最后,在SC-19感染模型中,加入不同濃度溶血素溶血活性抑制劑-膽固醇,結(jié)果顯示膽固醇能夠劑量依賴地抑制鏈球菌感染引起的炎性小體的激活。結(jié)果證實,豬鏈球菌SC-19激活炎性小體的主要成分是溶血素且依賴其溶血活性。4.豬鏈球菌激活炎性小體是STSLS發(fā)生的重要原因為了進(jìn)一步探究SC-19激活炎性小體在STSLS中的作用,利用野生株SC-19與溶血活性突變株msly(P353L)分別感染小鼠,結(jié)果顯示在突變株感染組中,STSLS相關(guān)癥狀明顯減輕,證實msly(P353L)誘發(fā)STSLS的風(fēng)險降低,體內(nèi)炎性小體激活是STSLS形成的重要因素。因該突變株msly(P353L)的毒力降低,我們嘗試用該菌株作為弱毒疫苗,發(fā)現(xiàn)一次免疫即可提供完全保護(hù),暗示該突變株有開發(fā)成為弱毒疫苗的可能性。5.流行毒株SC-19所致的STSLS與溶血素高表達(dá)相關(guān)比較流行株SC-19和歐洲強毒株P(guān)1/7溶血素的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)兩者溶血素表達(dá)具有顯著差異,且不同菌株炎性小體激活程度與溶血素表達(dá)量密切相關(guān)。為了探究溶血素的表達(dá)差異對豬鏈球菌誘發(fā)STSLS造成的影響,實驗中構(gòu)建溶血素表達(dá)質(zhì)粒,并對溶血素缺失菌株進(jìn)行回補,在相對低表達(dá)的菌株P(guān)1/7實現(xiàn)過表達(dá)。結(jié)果顯示,回補菌株能表達(dá)溶血素且恢復(fù)毒力,而溶血素過表達(dá)的菌株能提高P1/7的致死率。這些結(jié)果顯示溶血素的高表達(dá)在SC-19所致的STSLS中發(fā)揮重要作用。綜上,我們證實了豬鏈球菌2型分泌的溶血素能激活NLRP3炎性小體,誘導(dǎo)炎性“風(fēng)暴”,促進(jìn)了STSLS的發(fā)生。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.611
【圖文】：

圖 1-1. 豬鏈球菌引起疾病的發(fā)病機(jī)制和流行病學(xué)特征[11]Fig. 1-1 Pathogenesis and Epidemiological Features of Streptococcus suisDisease[11]

圖 1-2. 豬鏈球菌侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)[12]Fig.1-2 Invasion of the CNS[12]豬鏈球菌還可通過激活小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞，以及其他可能的細(xì)胞類型，

圖 1-3. 鑒定流行菌株中的 89K“毒力島”[21]1-3 Identification of 89K, a putative PAI, through comparative genom學(xué)者收集不同臨床表現(xiàn)的菌株，包括非臨床菌株、呼吸系統(tǒng)菌株和系

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4 許仲e

本文編號：2751507