【摘要】：1型鴨甲肝病毒(Duck Hepatitis A Virus Type 1,DHAV-1)臨床上主要引起雛鴨急性肝炎,并具有高度致死性。VP1蛋白是DHAV-1主要衣殼蛋白,并誘導機體產(chǎn)生中和抗體�，F(xiàn)有最靈敏特異的DHAV-1診斷方法主要是基于單克隆抗體(monoclonal antibodies,mAbs),但mAbs制作成本高,很難大規(guī)模生產(chǎn)等因素,限制了其在相關領域的應用。為了尋找傳統(tǒng)mAbs的替代抗體,本研究以商品化DHAV-1活疫苗為免疫原免疫雙峰駝,成功構建了大小為6×10~6、插入率為96%的噬菌體展示免疫納米抗體(Nanobody,Nb)庫,以DHAV-1 VP1蛋白為抗原進行了三輪特異性納米抗體篩選,成功篩選鑒定了一株DHAV-1納米抗體。在此基礎上,本研究成功鑒定了該納米抗體的線性表位為~(174)PAPTST~(179),其在DHAV-1毒株之間高度保守,為特異靈敏檢測DHAV-1提供了強有力的工具。本研究內容分主要分為以下三部分:1.全長DHAV-1 VP1蛋白的原核表達以DHAV-1傳染性克隆為模板,利用PCR擴增VP1基因片段,通過EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點將其分別克隆入pET-32a(+)和pGEX-6P-1原核表達載體,轉化到Rosetta(DE3)表達菌株,37℃1mM IPTG誘導3h后,經(jīng)SDS-PAGE和Western blot鑒定VP1-His和VP1-GST蛋白得到成功表達。2.DHAV-1VP1蛋白納米抗體的篩選與鑒定以商品化DHAV-1活疫苗為免疫原免疫雙峰駝,6次免疫過后,通過ELISA鑒定血清中DHAV-1特異性抗體滴度為1:50000。提取外周血淋巴細胞總RNA,通過RT-PCR得到cDNA,以cDNA為模板,經(jīng)巢式PCR得到目的VHH基因,通過酶切位點連接到pCANTAB 5E噬菌粒載體,轉化雄性大腸桿菌TG1,成功構建了大小為6×10~6的噬菌體展示免疫納米抗體庫。以VP1-His為靶標,經(jīng)過3輪富集篩選,成功篩選得到1株特異性針對DHAV-1 VP1的納米抗體,命名為Nb25。3.Nb25抗原表位的鑒定首先將DHAV-1 VP1基因分五段,通過EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點分別克隆入pGEX-6P-1原核表達載體,轉化到Rosetta(DE3)表達菌株,誘導表達后分段蛋白經(jīng)Dot-blot鑒定,初步鑒定Nb25表位位于~(172)PLPAPTSTTS~(181)之間,然后將肽段~(172)PLPAPTSTTS~(181)分別從N端和C端縮進,將截短的6個肽段進行Dot-blot鑒定,經(jīng)鑒定~(174)PAPTST~(179)為Nb25精確表位。經(jīng)同源性對比,該表位在NCBI已發(fā)布DHAV-1毒株中高度保守,而在DHAV-2和DHAV-3存在變異。綜上所述,本研究成功利用噬菌體展示技術篩選制備了針對DHAV-1的納米抗體Nb25,并且Nb25具有高度特異性,只與DHAV-1病毒離子反應,與其他病毒不反應。
【學位授予單位】：山東農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S852.65
【圖文】：

圖 3-1 VP1基因 PCR 擴增結果Fig.3-1 PCR product of VP1M: DNA Marker; 1. PCR product of VP1體酶切鑒定為 pET-VP1，pGEX-VP1，將 pET切，結果如圖 3-2 所示。

圖 3-1 VP1基因 PCR 擴增結果Fig.3-1 PCR product of VP1M: DNA Marker; 1. PCR product of VP1載體酶切鑒定名為 pET-VP1，pGEX-VP1，將 pET-V雙酶切，結果如圖 3-2 所示。

圖 3-3 不同時間條件下 VP1-His融合蛋白表達情況M：蛋白 Marker；1. pET32a；2-6. VP1-His融合蛋白在 2h, 3h, 4h, 5h, 6h表達情況Fig.3-3 The expression of VP1-His fusion protein under different time conditionsM: Protein Marker;1. pET32a; 2-6. Induction time of 2h, 3h, 4h, 5h, 6h, respectively.圖 3-4 不同時間條件下 VP1-GST 融合蛋白表達情況

【參考文獻】

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本文編號：2748897