【摘要】：奶牛乳房炎是奶牛乳腺組織因細(xì)菌感染、外傷或化學(xué)刺激所引起的乳房炎癥,給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。已報(bào)導(dǎo)約有150種病原菌與奶牛乳房炎相關(guān),90%以上病例主要因葡萄球菌、大腸桿菌和鏈球菌感染導(dǎo)致,其中葡萄球菌占到約50%。奶牛乳房炎致病菌往往都有形成生物被膜的能力,吸附于物體表面固著生長的細(xì)菌群體通常被稱作“生物被膜”,致病菌生物被膜通常與許多持續(xù)性和慢性感染性疾病有關(guān)。當(dāng)致病菌形成生物被膜之后,可在一定程度上逃避免疫系統(tǒng)的攻擊從而很難被宿主清除,抗生素雖然可以減緩生物被膜細(xì)菌產(chǎn)生的致病性影響,但是由于其不能有效地作用于生物被膜里層細(xì)菌,以至對(duì)于生物被膜引起的慢性感染難以根治。目前針對(duì)奶牛乳房炎致病菌生物被膜的研究尚不全面,本研究針對(duì)奶牛乳房炎致病金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的生物被膜展開研究,探求上述細(xì)菌生物被膜的功能基因及調(diào)控機(jī)制,探索對(duì)生物被膜細(xì)菌有針對(duì)性的治療藥物前體分子,同時(shí)研究上述藥物與抗生素聯(lián)合使用的實(shí)驗(yàn)條件,以期為奶牛乳房炎致病菌的防治提供新的治療思路及藥物靶標(biāo)。主要研究結(jié)果如下:1.乳糖和牛奶可以增強(qiáng)金黃色葡萄球菌分離株S.aureus DCM1和S.aureus DCM2的生物被膜的形成能力。熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)表明,乳糖是通過上調(diào)PIA合成酶基因ica ABCD操縱子影響生物被膜的形成的。而牛奶除了上調(diào)PIA的合成,還上調(diào)了其它一些生物被膜相關(guān)蛋白的表達(dá)量。2.地榆醇提物顯著抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)菌株SA3的生物被膜的形成能力。在添加地榆醇提物之后,ica ABCD的轉(zhuǎn)錄水平有明顯的下降,而ica R的轉(zhuǎn)錄水平會(huì)隨著地榆的添加而升高,證明了地榆是通過影響ica R的轉(zhuǎn)錄來調(diào)控ica操縱子的。3.群體感應(yīng)信號(hào)分子AI-2通過提高ica操縱子和一種生物被膜相關(guān)蛋白的編碼基因bhp的轉(zhuǎn)錄來促進(jìn)表皮葡萄球菌菌株RP62A的生物被膜的形成。此外,一些已知的與生物被膜相關(guān)的調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄水平的檢測結(jié)果顯示,只有ica R的轉(zhuǎn)錄水平隨著AI-2的添加發(fā)生了較明顯的變化,表明了AI-2主要是通過ica R依賴的途徑影響生物被膜形成的。4.玉米須水提液通過提高ica操縱子的轉(zhuǎn)錄水平抑制MRSA菌的生物被膜的形成。此外,體外抑菌性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在生物膜生長狀態(tài)下,玉米須水提液能夠增強(qiáng)MRSA菌株對(duì)萬古霉素的敏感性。5.槲皮素-銀納米顆粒(QA NPs)相比于槲皮素(Qe)和銀納米顆粒(Ag NPs)對(duì)大腸桿菌菌株ECDCM1具有更強(qiáng)的抑菌活性和抑制生物被膜形成的能力。熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,QA NPs是通過下調(diào)bcs A、csg A、fli C、fim A、mot A和wca F這些生物被膜相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平來抑制菌株ECDCM1的生物被膜的形成的。
【學(xué)位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.61
【圖文】：

圖 1.1 生物被膜形成過程。Fig 1.1 bioformation of biofilm圖注：圖片引自 Paul Stoodley, Peg Dirckx, Center for Biofilm Engineering, Motana State University。生物被膜的形成與解離通常由環(huán)境中的壓力條件引起，許多環(huán)境壓力因子可觸發(fā)細(xì)菌生物被膜的形成，例如細(xì)菌的密度，外部環(huán)境中的滲透壓，鐵離子濃度氧濃度等等，當(dāng)細(xì)菌感受到這些壓力因素之后，通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，將信號(hào)傳遞胞內(nèi)，引起靶基因表達(dá)的變化從而形成生物被膜結(jié)構(gòu)[65]。近年來有些研究者認(rèn)為還有一些外源物的刺激也可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌已經(jīng)形成的生物被膜瓦解。其機(jī)理可能直接作用于生物被膜結(jié)構(gòu)本身促其降解或者是通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑使細(xì)菌自身實(shí)現(xiàn)降解生物被膜的降解調(diào)控，以此為出發(fā)點(diǎn)可以探尋那些針對(duì)生物被膜為靶標(biāo)的新治療藥物或者抗生素的輔助藥物[17, 66]。1.4.4 生物被膜的致病性表現(xiàn)對(duì)于病原菌來說，形成生物被膜可能有助于其致病性的增強(qiáng)。生物被膜細(xì)菌

生物被膜還含有細(xì)菌分泌的大分子多聚物、吸附的營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物及細(xì)胞裂解產(chǎn)物等[86, 87]（圖1.2）。成膜基因的表達(dá)是生物被膜形成的先決條件，已知金黃色葡萄球菌中主要的生物被膜基因?yàn)?ica operon，它是由 4 個(gè)基因 icaA、icaB、icaC、icaD 組成的基因簇，4 個(gè)基因共轉(zhuǎn)錄，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄 PIA 合成的功能基因，大部分金黃色葡萄球菌的生物被膜形成的前提就是 ica operon 的正常表達(dá)[1, 88]，然而近年來也有報(bào)道，有些金黃色葡萄球菌的生物被膜形成是 PIA 非依賴的，它們可能通過以分泌到胞外的蛋白組分為主體構(gòu)建其生物被膜，一些表面蛋白的合成基因的表達(dá)可能與其生物被膜的形成密切相關(guān)，例如 bap

到TSB培養(yǎng)基中，并且終濃度分別被調(diào)節(jié)到0%、0.1%、0.2%和0.4%。細(xì)胞培養(yǎng)物被轉(zhuǎn)移到96孔培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)，經(jīng)過結(jié)晶紫染色，最終我們觀察到了不同條件下的細(xì)菌生物被膜形成量。如圖2.1A所示，在奶牛源金黃色葡萄球菌分離株S. aureus DCM1和S. aureus DCM2中，加入乳糖或者牛奶均會(huì)引起生物被膜形成量的明顯增加，而人源金黃色葡萄球菌分離株S. aureus NCTC8325并不會(huì)受到影響。此外，我們用酶標(biāo)儀檢測了生物被膜的形成量，檢測結(jié)果表明在菌株S. aureus DCM1和S. aureus DCM2中，隨著乳糖或牛奶添加量的增加，生物被膜的形成量會(huì)有相應(yīng)程度的增加（圖2.1B）。因?yàn)榧尤肱Ｄ袒蛘呷樘撬鸬纳锉荒ば纬闪康脑黾映潭却笾孪嗤�，因此我們猜測乳糖是牛奶當(dāng)中主要影響生物被膜形成的組分。

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