【摘要】：益生菌被定義為當(dāng)以適當(dāng)?shù)牧渴┯脮r(shí),賦予宿主健康益處的活的微生物。通常指的益生菌為益生性細(xì)菌,由于細(xì)菌培養(yǎng)方式簡單、增殖速度快、環(huán)境耐受性強(qiáng)等特點(diǎn),被廣泛開發(fā)和應(yīng)用。但是益生性細(xì)菌也有其致命的弱點(diǎn),例如基因轉(zhuǎn)移,容易導(dǎo)致抗性基因的傳播。真菌具有遺傳隔離的特性,能夠有效避免抗性基因的轉(zhuǎn)移。真菌細(xì)胞壁中的β-葡聚糖已被證明是一種高效的益生物質(zhì),能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫水平。另外,真菌作為載體表達(dá)的基因工程產(chǎn)物具有天然構(gòu)象,可以作為良好的疫苗輸送平臺(tái)。這些都表明真菌具有作為優(yōu)良益生菌被開發(fā)的潛力。益生菌的作用機(jī)制是復(fù)雜的,但主要包括以下幾個(gè)方面。第一,增重和提高飼料利用率是開發(fā)畜禽腸道益生菌的首要目的,所以提高生長性能是權(quán)衡益生效果的重要指標(biāo)。第二,消化系統(tǒng)的發(fā)育狀況影響機(jī)體對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用,促進(jìn)消化系統(tǒng)的發(fā)育,也是評(píng)價(jià)益生菌的一個(gè)因素。第三,免疫狀態(tài)直接決定機(jī)體的健康水平,益生菌株應(yīng)該能夠調(diào)節(jié)宿主的免疫水平。最后,腸道菌群影響機(jī)體代謝和對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收,益生菌株能夠維持腸道菌群的平衡,并促進(jìn)腸道菌群向有益的方向發(fā)展�，F(xiàn)階段,益生菌株主要從自然界分離獲得,通過隨機(jī)誘變或者基因定向改造獲取益生菌株的方式比較少見。本實(shí)驗(yàn)室前期從雛雞糞便中分離得到一株D.rugosa SD,預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)D.rugosa SD在雛雞腸道不定植且不耐受腸道惡劣內(nèi)環(huán)境。本課題基于此菌株,通過誘變篩選獲得腸道定植能力強(qiáng)的變異株,旨在進(jìn)一步研究其菌株特異性及其益生作用機(jī)制。1.腸道定植菌株篩選及菌株特異性分析本研究以存活率50%~70%為標(biāo)準(zhǔn),確定了UV及NTG誘變劑的最佳誘變條件:15J,0.4min和50 mg/m L,40 min。進(jìn)而以復(fù)合誘變的方式,以在雛雞腸道內(nèi)定植12 h為篩選條件,成功篩選到23株突變菌株。經(jīng)過20次遺傳穩(wěn)定性檢測,最終獲得一株能夠穩(wěn)定遺傳的變異菌株。通過物種進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn),變異菌株與模式菌株D.rugosa ATCC10571的親緣關(guān)系最近(自展值100%),最終命名為D.rugosa SD-17。D.rugosa SD-17生物學(xué)特性發(fā)生了顯著變化,主要表現(xiàn)在:D.rugosa SD-17在41℃的增殖能力顯著增強(qiáng);D.rugosa SD-17在YTD固體培養(yǎng)基上的菌落中央出現(xiàn)明顯的凹陷;經(jīng)過透射電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)D.rugosa SD-17的細(xì)胞壁顯著增厚;D.rugosa SD-17的細(xì)胞壁及其β-葡聚糖含量顯著提高。2.D.rugosa SD-17的益生潛力研究為了進(jìn)一步探究D.rugosa SD-17的益生潛力,本研究通過模擬腸道內(nèi)環(huán)境(胃酸、膽鹽和溫度)的方法來研究D.rugosa SD-17的耐受性。結(jié)果表明經(jīng)過人工胃酸(p H=2)處理8 h,D.rugosa SD-17的存活率仍接近50%;0.3%的人工膽鹽對(duì)D.rugosa SD-17的增殖沒有顯著影響;D.rugosa SD-17在畜禽腸道溫度(37℃~41℃)下能夠良好生長。通過細(xì)胞粘附試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),D.rugosa SD-17對(duì)Caco-2細(xì)胞的粘附率為61.5%,顯著高于模式菌株。使用D.rugosa SD-17灌胃雛雞,并在16 h后收集腸內(nèi)容物涂板培養(yǎng),結(jié)果從回腸內(nèi)容物中分離出大量的D.rugosa SD-17,這說明D.rugosa SD-17在雛雞腸道內(nèi)的主要定植部位為回腸。以上結(jié)果表明D.rugosa SD-17對(duì)模擬的腸道內(nèi)環(huán)境有良好的耐受力并能夠在雛雞腸道內(nèi)短暫定植。3.D.rugosa SD-17對(duì)雛雞的益生作用研究本研究通過急性毒性試驗(yàn)和慢性感染性試驗(yàn)來評(píng)價(jià)D.rugosa SD-17對(duì)雛雞的安全性。結(jié)果均未引起雛雞死亡,另外,雛雞精神狀態(tài)良好、采食量正常、表觀和內(nèi)臟無病理性變化、全血檢測指標(biāo)正常,這些結(jié)果說明D.rugosa SD-17對(duì)雛雞沒有致病性。動(dòng)物益生性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),飼料中添加D.rugosa SD-17會(huì)顯著提高雛雞增重和飼料利用率,并且促進(jìn)回腸絨毛的發(fā)育,回腸恰巧也是D.rugosa SD-17最主要的定植部位,這表明該菌株對(duì)回腸上皮細(xì)胞可能有一定的刺激作用。在刀豆蛋白A(Con A)的刺激下,D.rugosa SD-17組的淋巴細(xì)胞增殖能力顯著提高。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測淋巴細(xì)胞亞群,結(jié)果發(fā)現(xiàn)D.rugosa SD-17會(huì)顯著提高CD3+CD4+細(xì)胞(T helper cells,Th)的比例。另外,通過熒光定量PCR檢測Th細(xì)胞表面的標(biāo)志性細(xì)胞因子,結(jié)果發(fā)現(xiàn)D.rugosa SD-17會(huì)促進(jìn)Th1細(xì)胞標(biāo)志性細(xì)胞因子的基因表達(dá)量,而對(duì)Th2細(xì)胞標(biāo)志性細(xì)胞因子的基因表達(dá)量沒有影響,這些結(jié)果表明D.rugosa SD-17對(duì)雛雞有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。4.D.rugosa SD-17對(duì)腸道菌群的影響本研究通過16S擴(kuò)增子測序分析回腸菌群、盲腸菌群、結(jié)腸菌群和糞便菌群的變化來揭示D.rugosa SD-17對(duì)小鼠的腸道內(nèi)環(huán)境的影響。首先,D.rugosa SD-17的刺激引起回腸菌群豐富度的顯著提高。其次,D.rugosa SD-17的刺激會(huì)引起糞便菌群中厚壁菌門的比例升高,擬桿菌門的比例降低,這有利于提高機(jī)體對(duì)能量的吸收和利用。另外,D.rugosa SD-17的刺激會(huì)引起有益菌屬(乳酸桿菌屬)比例的顯著升高。這些結(jié)果初步表明,D.rugosa SD-17能夠調(diào)整小鼠腸道的菌群結(jié)構(gòu),并增加有益菌群的比例。5.D.rugosa SD-17對(duì)代謝通路的影響根據(jù)小鼠腸道菌群測序的結(jié)果,本研究通過KEEG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行富集分析,旨在揭示D.rugosa SD-17對(duì)小鼠代謝水平的影響。從結(jié)腸菌群中富集到5個(gè)D.rugosa SD-17特異性代謝通路,分別涉及細(xì)胞粘附分子、細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)、病毒的感染及心肌病等代謝領(lǐng)域。本研究選取細(xì)胞粘附分子通路進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)E-cadherin是腸道粘附連接的核心蛋白。為了進(jìn)一步研究D.rugosa SD-17對(duì)小鼠結(jié)腸粘附連接的影響,我們用D.rugosa SD-17分別刺激結(jié)腸組織和Caco-2細(xì)胞,結(jié)果都顯示E-cadherin表達(dá)量顯著提高。另外,粘附連接的其它相關(guān)蛋白(β-catenin、ZO-1等)的表達(dá)量都發(fā)生了不同程度的顯著上調(diào)。這些結(jié)果表明D.rugosa SD-17顯著提高結(jié)腸粘附連接的相關(guān)蛋白的基因表達(dá)量,對(duì)維持腸道結(jié)構(gòu)有一定的促進(jìn)作用。綜上所述,本課題成功獲取一株腸道定植能力強(qiáng)的益生性菌株D.rugosa SD-17,該菌株具有明顯的菌株特異性,對(duì)雛雞有良好的益生作用,并能夠優(yōu)化腸道菌群和維持腸道結(jié)構(gòu)。本研究為深入研究畜禽腸道益生菌株的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ),并為畜禽腸道益生菌的開發(fā)和應(yīng)用提供指導(dǎo)意義。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S816.7
【圖文】：

圖 1 益生菌刺激 Th1，Th2，Th17 或 Treg 細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用（Dargahi et al., 2019）。Fig. 1 Immunomodulatory effects of probiotics stimulating T helper (Th)-1, Th2, Th17 cells or T regulatory (Treg) ce.1.3 益生菌的應(yīng)用動(dòng)物和人體臨床試驗(yàn)研究表明，益生菌具有預(yù)防或治療過敏癥（特應(yīng)性皮炎和過鼻炎）和自身免疫性疾病（IBD 和 MS）的潛力。通過益生菌調(diào)節(jié)腸道菌群已經(jīng)顯

圖 2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)Fig.2 Experimental design.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù) GenBank 中的相關(guān)序列或根據(jù)文章中已發(fā)表的引物，用 Premier 5.0 設(shè)計(jì)或相應(yīng)引物，并由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表 1。

圖 3 紫外線強(qiáng)度（或作用時(shí)間）與 D. rugosa 存活率的關(guān)系Fig. 3 The relationship between UV intensity (or duration of action) and D. rugosa survival rateTG 最佳誘變條件的選擇G 誘變劑對(duì) D. rugosa 有明顯的抑制作用。10 mg/mL，180 min 的條件下，率僅為 51%；當(dāng)作用濃度提高到 50 mg/mL，作用 3 h 后 D. rugosa 的存

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本文編號(hào)：2747990