【摘要】：鵝養(yǎng)殖業(yè)是近年興起的朝陽(yáng)產(chǎn)業(yè),而鵝季節(jié)性產(chǎn)蛋特點(diǎn)是制約養(yǎng)鵝業(yè)發(fā)展的一個(gè)重要因素。對(duì)鵝卵泡發(fā)育機(jī)制的探究有助于我國(guó)鵝養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)進(jìn)步�，F(xiàn)有研究表明p38MAPK信號(hào)通路對(duì)家禽的卵泡發(fā)育存在一定的調(diào)控作用,本研究選擇處于產(chǎn)蛋高峰期的籽鵝,采集其等級(jí)前卵泡,使用免疫組織化學(xué)(IHC)技術(shù)確定通路上關(guān)鍵基因在等級(jí)前卵泡中的表達(dá)位點(diǎn);使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)目的基因在mRNA水平的表達(dá)情況;使用蛋白免疫印跡(Western Blot)技術(shù)檢測(cè)目的基因在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)情況,并利用顯著性檢驗(yàn)和相關(guān)性分析初步分析目的基因的生物學(xué)功能。研究試驗(yàn)結(jié)果如下:(1)通過qPCR技術(shù)對(duì)p38MAPK信號(hào)通路上關(guān)鍵基因在籽鵝等級(jí)前卵泡中的表達(dá)量進(jìn)行mRNA水平的探究,并進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)研究中所有目的基因在5種等級(jí)前卵泡中均表達(dá),且表達(dá)量的最大值和最小值存在顯著性差異(p0.05)。其中,目的基因TGF-βI、TGF-βRII、Fas、Fasl的表達(dá)規(guī)律呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì),在MWF中的表達(dá)量最高;目的基因DAXX、ASK1、MKK3、MKK6、p38α的表達(dá)規(guī)律呈現(xiàn)先減少再增加而后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì),在MWF中的表達(dá)量最低,其中ASK1在SYF中的表達(dá)量最高,而其余基因在pe卵泡中的表達(dá)量最高。(2)對(duì)qPCR試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),p38MAPK信號(hào)通路上基因的相關(guān)性存在時(shí)空差異性。在pe卵泡、SWF、MWF中,TGF-β及其受體對(duì)信號(hào)通路其主要調(diào)控作用,且抑制信號(hào)通路中支持卵泡發(fā)育的相關(guān)基因的表達(dá);而在LWF和SYF中,Fas、Fasl對(duì)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用增強(qiáng),卵泡發(fā)育得到支持促進(jìn)。(3)通過IHC試驗(yàn)對(duì)目的蛋白ASK1和p38α在籽鵝等級(jí)前卵泡的表達(dá)進(jìn)行定位分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種目的蛋白在籽鵝5種等級(jí)前卵泡中的膜層細(xì)胞(TC)和顆粒層細(xì)胞(GC)中均檢測(cè)出陽(yáng)性表達(dá)位點(diǎn),且存在一定的時(shí)空差異性。(4)通過Western Blot技術(shù)對(duì)目的基因ASK1、MKK3、p38α在籽鵝等級(jí)前卵泡中的表達(dá)量進(jìn)行蛋白質(zhì)水平的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)三種目的蛋白在等級(jí)前卵泡中表達(dá)量的整體趨勢(shì)與qPCR試驗(yàn)結(jié)果一致,但存在一定差異,而相關(guān)性分析結(jié)果也與qPCR結(jié)果存在一定差異。(5)結(jié)合卵泡發(fā)育規(guī)律及p38MAPK信號(hào)通路上基因的表達(dá)規(guī)律可以發(fā)現(xiàn),p38MAPK信號(hào)通路對(duì)籽鵝等級(jí)前卵泡存在一定的促進(jìn)支持作用,其中TGF-βI、TGF-βRII、Fas、Fasl對(duì)卵泡發(fā)育起抑制作用,DAXX、ASK1、MKK3、MKK6、p38α對(duì)卵泡發(fā)育起促進(jìn)作用。
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S835
【圖文】：

圖 1.1 鵝等級(jí)前卵泡Fig.1.1 pre-hierarchical follicles of Geese象使得大部分卵泡沒有完成發(fā)育即發(fā)生退化，這一個(gè)重要原因[4, 6]。卵泡的閉鎖是一個(gè)有機(jī)體調(diào)控的LH 等生殖激素的調(diào)控[27]，又受到一些細(xì)胞因子及是一個(gè)不可逆過程，發(fā)生閉鎖的卵泡在形態(tài)上與閉鎖卵泡表面會(huì)出現(xiàn)凹陷，同時(shí)有紅斑，卵泡膜細(xì)生破裂，卵泡液發(fā)生溢出[11, 31]。卵泡在各個(gè)發(fā)育階尚不成熟，體積較小的卵泡中，卵泡的閉鎖由卵母，體積較大的卵泡中，閉鎖過程由顆粒細(xì)胞調(diào)控[1對(duì)于卵泡是否發(fā)生閉鎖有著重要作用，有研究表明增殖或凋亡會(huì)影響卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程，而且會(huì)打

圖 1.2 MAPK 信號(hào)通路圖Fig.1.2 MAPK signaling pathway注：圖中綠色邊框中所含基因即為本試驗(yàn)所研究的目的基因。MAPK 的級(jí)聯(lián)調(diào)控嚴(yán)格遵循上下游模式。即：上游的細(xì)胞因子與特異性受體（或配體）結(jié)合，產(chǎn)生信號(hào)，傳遞到下游蛋白（DAXX），接著傳遞到下游的MAPKKK（ASK1），隨后是 MAPKK（MKK3/6）最后到達(dá) MAPK（p38）。而激活的 p38MAPK 進(jìn)一步磷酸化，會(huì)激活后續(xù)的激酶，從而調(diào)節(jié)機(jī)體的各項(xiàng)生理過程。從以上激活過程可以看出，MAPK 的激活前體物質(zhì) MAPKK 和 MAPKKK 的種類較為單一，而 MAPKKK 的前體物質(zhì)則有很多[45, 46]。同時(shí)，不同種類的 MAPK信號(hào)通路之間也存在著協(xié)同或拮抗作用的關(guān)系[47]。p38MAPK 在 1993 年由 Brewster 研究發(fā)現(xiàn)。Brewster 等[38, 48]對(duì)巨噬細(xì)胞使用脂多糖（LPS）進(jìn)行刺激，首先發(fā)現(xiàn)了這種激酶。隨后，Han[16]等對(duì)這種試驗(yàn)的產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，得到一種蛋白質(zhì)。分子量約為 38KDa，包含 360 多個(gè)氨基酸，由此，這種蛋白被命名為 p38MAPK。p38MAPK 是 MAPK 家族的重要成員，參與多種生物學(xué)反應(yīng)，如炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖與凋亡、組織分化、腫瘤發(fā)生、

rimer 0.6rimer 0.6 2 dH2O 6.4X 0.4ume 20的基因在 5 個(gè)等級(jí)前卵泡的相對(duì)表達(dá)量使SPSS 19.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。泳對(duì)試驗(yàn)用籽鵝 5 種等級(jí)前卵泡的總 R8s，28s 處條帶清晰，無(wú)雜帶，證明其質(zhì)示。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2746982