發(fā)布時間：2020-07-08 20:06

【摘要】：鵝養(yǎng)殖業(yè)是近年興起的朝陽產(chǎn)業(yè),而鵝季節(jié)性產(chǎn)蛋特點是制約養(yǎng)鵝業(yè)發(fā)展的一個重要因素。對鵝卵泡發(fā)育機制的探究有助于我國鵝養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)進步�，F(xiàn)有研究表明p38MAPK信號通路對家禽的卵泡發(fā)育存在一定的調(diào)控作用,本研究選擇處于產(chǎn)蛋高峰期的籽鵝,采集其等級前卵泡,使用免疫組織化學(IHC)技術確定通路上關鍵基因在等級前卵泡中的表達位點;使用實時熒光定量PCR(qPCR)檢測目的基因在mRNA水平的表達情況;使用蛋白免疫印跡(Western Blot)技術檢測目的基因在蛋白質(zhì)水平的表達情況,并利用顯著性檢驗和相關性分析初步分析目的基因的生物學功能。研究試驗結(jié)果如下:(1)通過qPCR技術對p38MAPK信號通路上關鍵基因在籽鵝等級前卵泡中的表達量進行mRNA水平的探究,并進行顯著性檢驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)研究中所有目的基因在5種等級前卵泡中均表達,且表達量的最大值和最小值存在顯著性差異(p0.05)。其中,目的基因TGF-βI、TGF-βRII、Fas、Fasl的表達規(guī)律呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢,在MWF中的表達量最高;目的基因DAXX、ASK1、MKK3、MKK6、p38α的表達規(guī)律呈現(xiàn)先減少再增加而后趨于穩(wěn)定的趨勢,在MWF中的表達量最低,其中ASK1在SYF中的表達量最高,而其余基因在pe卵泡中的表達量最高。(2)對qPCR試驗結(jié)果進行相關性分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),p38MAPK信號通路上基因的相關性存在時空差異性。在pe卵泡、SWF、MWF中,TGF-β及其受體對信號通路其主要調(diào)控作用,且抑制信號通路中支持卵泡發(fā)育的相關基因的表達;而在LWF和SYF中,Fas、Fasl對信號通路的調(diào)節(jié)作用增強,卵泡發(fā)育得到支持促進。(3)通過IHC試驗對目的蛋白ASK1和p38α在籽鵝等級前卵泡的表達進行定位分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種目的蛋白在籽鵝5種等級前卵泡中的膜層細胞(TC)和顆粒層細胞(GC)中均檢測出陽性表達位點,且存在一定的時空差異性。(4)通過Western Blot技術對目的基因ASK1、MKK3、p38α在籽鵝等級前卵泡中的表達量進行蛋白質(zhì)水平的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)三種目的蛋白在等級前卵泡中表達量的整體趨勢與qPCR試驗結(jié)果一致,但存在一定差異,而相關性分析結(jié)果也與qPCR結(jié)果存在一定差異。(5)結(jié)合卵泡發(fā)育規(guī)律及p38MAPK信號通路上基因的表達規(guī)律可以發(fā)現(xiàn),p38MAPK信號通路對籽鵝等級前卵泡存在一定的促進支持作用,其中TGF-βI、TGF-βRII、Fas、Fasl對卵泡發(fā)育起抑制作用,DAXX、ASK1、MKK3、MKK6、p38α對卵泡發(fā)育起促進作用。
【學位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S835
【圖文】：

圖 1.1 鵝等級前卵泡Fig.1.1 pre-hierarchical follicles of Geese象使得大部分卵泡沒有完成發(fā)育即發(fā)生退化，這一個重要原因[4, 6]。卵泡的閉鎖是一個有機體調(diào)控的LH 等生殖激素的調(diào)控[27]，又受到一些細胞因子及是一個不可逆過程，發(fā)生閉鎖的卵泡在形態(tài)上與閉鎖卵泡表面會出現(xiàn)凹陷，同時有紅斑，卵泡膜細生破裂，卵泡液發(fā)生溢出[11, 31]。卵泡在各個發(fā)育階尚不成熟，體積較小的卵泡中，卵泡的閉鎖由卵母，體積較大的卵泡中，閉鎖過程由顆粒細胞調(diào)控[1對于卵泡是否發(fā)生閉鎖有著重要作用，有研究表明增殖或凋亡會影響卵泡的生長發(fā)育進程，而且會打

圖 1.2 MAPK 信號通路圖Fig.1.2 MAPK signaling pathway注：圖中綠色邊框中所含基因即為本試驗所研究的目的基因。MAPK 的級聯(lián)調(diào)控嚴格遵循上下游模式。即：上游的細胞因子與特異性受體（或配體）結(jié)合，產(chǎn)生信號，傳遞到下游蛋白（DAXX），接著傳遞到下游的MAPKKK（ASK1），隨后是 MAPKK（MKK3/6）最后到達 MAPK（p38）。而激活的 p38MAPK 進一步磷酸化，會激活后續(xù)的激酶，從而調(diào)節(jié)機體的各項生理過程。從以上激活過程可以看出，MAPK 的激活前體物質(zhì) MAPKK 和 MAPKKK 的種類較為單一，而 MAPKKK 的前體物質(zhì)則有很多[45, 46]。同時，不同種類的 MAPK信號通路之間也存在著協(xié)同或拮抗作用的關系[47]。p38MAPK 在 1993 年由 Brewster 研究發(fā)現(xiàn)。Brewster 等[38, 48]對巨噬細胞使用脂多糖（LPS）進行刺激，首先發(fā)現(xiàn)了這種激酶。隨后，Han[16]等對這種試驗的產(chǎn)物進行分離純化，得到一種蛋白質(zhì)。分子量約為 38KDa，包含 360 多個氨基酸，由此，這種蛋白被命名為 p38MAPK。p38MAPK 是 MAPK 家族的重要成員，參與多種生物學反應，如炎癥反應、細胞增殖與凋亡、組織分化、腫瘤發(fā)生、

rimer 0.6rimer 0.6 2 dH2O 6.4X 0.4ume 20的基因在 5 個等級前卵泡的相對表達量使SPSS 19.0 進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。泳對試驗用籽鵝 5 種等級前卵泡的總 R8s，28s 處條帶清晰，無雜帶，證明其質(zhì)示。

【參考文獻】

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