【摘要】：骨骼肌作為一類橫紋肌,是生物體中最重要的運(yùn)動(dòng)器官,而畜禽的骨骼肌不僅可以作為重要的運(yùn)動(dòng)器官,還是人類攝取優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的重要來源之一,因此對(duì)畜禽骨骼肌發(fā)育的研究就顯得尤為重要。衛(wèi)星細(xì)胞作為動(dòng)物骨骼肌的祖細(xì)胞,是一類未分化的單核細(xì)胞,定位于肌纖維基膜和肌細(xì)胞膜之間的間隙,緊緊粘附于肌纖維。衛(wèi)星細(xì)胞可以參與肌纖維的發(fā)育并為其所附著的肌纖維提供細(xì)胞核。動(dòng)物出生后骨骼肌中的衛(wèi)星細(xì)胞會(huì)逐漸轉(zhuǎn)為靜息狀態(tài)。當(dāng)肌纖維受損時(shí),衛(wèi)星細(xì)胞可以被激活并開始進(jìn)行不對(duì)稱分裂,一部分子細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞循環(huán)開始大量增殖并進(jìn)行肌源性分化,參與肌纖維的再生;另一部分子細(xì)胞則退出細(xì)胞循環(huán)轉(zhuǎn)為靜息狀態(tài),進(jìn)行自我更新,從而維持處于靜息狀態(tài)的衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)目的穩(wěn)定,因此衛(wèi)星細(xì)胞具有干細(xì)胞的特性,是一種肌源性的祖細(xì)胞。本研究用C57/BL6小鼠為模型,在細(xì)胞水平和組織水平探討骨骼肌發(fā)育過程中衛(wèi)星細(xì)胞的分化能力以及調(diào)控機(jī)制,并對(duì)豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的發(fā)育規(guī)律進(jìn)行了初步研究。取得了以下結(jié)果:(1)哺乳動(dòng)物出生后骨骼肌中PAX7~+細(xì)胞數(shù)目逐漸減少。本研究選取出生后1天、8天、2周、4周、6周、8周、10周、12周、24周以及52周共10個(gè)時(shí)間點(diǎn)的小鼠的腓腸肌進(jìn)行組織切片免疫熒光檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),PAX7~+細(xì)胞數(shù)目在小鼠出生后1天時(shí)約為19.7%,但隨著年齡的增長顯著下降,在大于10周齡的小鼠中PAX7~+細(xì)胞數(shù)目的比率則穩(wěn)定在0.5%以下。(2)出生后小鼠衛(wèi)星細(xì)胞中MYF5、MYOD以及myogenin的表達(dá)模式。本研究對(duì)不同年齡小鼠腓腸肌進(jìn)行組織切片免疫熒光檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),MYF5~+細(xì)胞數(shù)目在小鼠出生1天到8周齡雖然有輕微的下降,但總體維持在較高水平,而在10周齡后則顯著下降。MYOD~+細(xì)胞數(shù)目在小鼠出生后不同的年齡段均維持在一個(gè)較低的水平。Myogenin~+細(xì)胞數(shù)目在小鼠出生后1天到2周顯著下降,但在4周和6周時(shí)顯著上升,隨后又顯著下降。(3)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分化能力隨著年齡的增長而下降。本研究選取出生后2周、4周、6周、8周、10周以及12周共6個(gè)時(shí)間點(diǎn)的小鼠腿肌用于衛(wèi)星細(xì)胞的分離和培養(yǎng),然后利用免疫熒光和Q-PCR實(shí)驗(yàn)檢測衛(wèi)星細(xì)胞的分化能力。免疫熒光和Q-PCR結(jié)果表明,骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞被誘導(dǎo)分化24 h和48 h后,分化標(biāo)志基因Mck和肌漿球蛋白(myosin)的表達(dá)水平隨著小鼠年齡的增長而呈現(xiàn)逐漸下調(diào)的趨勢。(4)不同時(shí)期衛(wèi)星細(xì)胞的差異表達(dá)基因鑒定。本研究分離了2周、4周、6周、8周、10周以及12周六個(gè)時(shí)間點(diǎn)的小鼠腿肌衛(wèi)星細(xì)胞,并對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。通過基因差異表達(dá)分析,本研究共得到了2907個(gè)DEGs。WGCNA分析發(fā)現(xiàn),這2907個(gè)DEGs可以被富集到6個(gè)主要的表達(dá)模塊,其中有1739個(gè)基因被富集到紅色模塊,且紅色模塊中的基因多與骨骼肌的發(fā)育過程相關(guān)(p0.01)。Pathway分析表明這1739個(gè)差異基因主要富集到12個(gè)信號(hào)通路(p0.01),包括細(xì)胞粘附,肥厚型心肌病,Wnt以及MAPK等。綜合Q-PCR驗(yàn)證分析和共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析,本研究篩選出三個(gè)關(guān)鍵基因,即Tgfβ2、Wnt9a和Fgfr4。(5)TGFβ2、TGFβ3以及WNT9a可以有效地抑制衛(wèi)星細(xì)胞的分化。在細(xì)胞水平,衛(wèi)星細(xì)胞分化時(shí)期Tgfβ2、Tgfβ3、Wnt9a、Akt2和Mknk2的表達(dá)水平與增殖期相比顯著上調(diào);利用si-RNA或Pirfenidone抑制TGFβ2、TGFβ3和WNT9a可以顯著促進(jìn)肌管的形成和MyHC2d以及Mck基因的表達(dá)。在組織水平,利用Pirfenidone抑制小鼠體內(nèi)TGFβ2蛋白的表達(dá)可以有效地促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞的激活和分化,從而促使衛(wèi)星細(xì)胞與肌管融合以及骨骼肌的再生。(6)FGFR4可以有效地促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞的分化。在衛(wèi)星細(xì)胞分化時(shí)期Fgfr4基因的表達(dá)與增殖期相比顯著上調(diào)。在衛(wèi)星細(xì)胞中抑制FGFR4蛋白表達(dá)可以顯著抑制肌管的形成和分化marker基因MyHC2d以及Mck的表達(dá)。(7)TGFβ2、FGFR4以及WNT9a通過影響衛(wèi)星細(xì)胞的激活狀態(tài)來調(diào)控骨骼肌的發(fā)育。本研究利用si-RNA抑制衛(wèi)星細(xì)胞中TGFβ2、TGFβ3、FGFR4和WNT9a蛋白的表達(dá),或利用Pirfenidone抑制細(xì)胞水平和組織水平TGFβ2的表達(dá)。Western blotting結(jié)果表明,TGFβ2、TGFβ3和WNT9a可以促進(jìn)PAX7的表達(dá),抑制MYOD的表達(dá);FGFR4可以抑制PAX7的表達(dá),促進(jìn)MYOD的表達(dá)。(8)TGFβ2,FGFR4和WNT9a蛋白之間具有相互調(diào)節(jié)作用。Western blotting結(jié)果表明,TGFβ2可以抑制FGFR4、WNT9a、AKT2和MKNK2蛋白的表達(dá);FGFR4可以抑制TGFβ2和WNT9a的表達(dá),促進(jìn)AKT2和MKNK2蛋白的表達(dá);而WNT9a可以促進(jìn)TGFβ2和FGFR4的表達(dá),但是對(duì)AKT2和MKNK2蛋白水平的影響不顯著。(9)對(duì)豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的初步研究。本研究選取大白豬胚胎35天、胚胎55天、出生1天、1月齡、2月齡、3月齡、6月齡以及12月齡共八個(gè)時(shí)間點(diǎn)的背最長肌進(jìn)行免疫熒光檢測。結(jié)果表明,MYF5~+細(xì)胞數(shù)目隨著骨骼肌的發(fā)育逐漸減少;MYOD~+細(xì)胞數(shù)目在胚胎期55天最高,但是在其它時(shí)期均較低;myogenin~+細(xì)胞數(shù)目從胚胎期到出生后逐漸下降。本研究通過對(duì)分離培養(yǎng)的衛(wèi)星細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化發(fā)現(xiàn),MYOD和myogenin作為分化早期marker,在細(xì)胞分化啟動(dòng)時(shí)表達(dá)上調(diào),隨后又顯著下調(diào)。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.2
【圖文】：

Fig. 1. Muscle structure and the location of satellite cell.骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的來源骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的首次發(fā)現(xiàn)是在 1961 年。Mauro 在利用電鏡觀察青蛙骨骼肌現(xiàn)了一類與肌纖維緊密粘附的單核細(xì)胞。這些細(xì)胞在肌纖維表面形成突起肌纖維膜和肌纖維基膜之間的空隙，并且細(xì)胞膜與基膜和肌纖維膜接觸但類細(xì)胞因其與肌纖維的位置關(guān)系而被 Mauro 命名為衛(wèi)星細(xì)胞（Mauro 196星細(xì)胞發(fā)現(xiàn)以來，其在骨骼肌發(fā)育過程中發(fā)揮的作用越來越受到人們重視祖細(xì)胞的發(fā)育分為胚胎期和出生后兩個(gè)階段，胚胎期的細(xì)胞稱為骨骼肌前而出生后則稱為衛(wèi)星細(xì)胞。Pax3 和 Pax7 是骨骼肌祖細(xì)胞的 marker 基因，的發(fā)育以及衛(wèi)星細(xì)胞特性的維持等方面具有重要的作用。研究表明，體節(jié)來源于軸旁中胚層和中胚層背側(cè)，而體節(jié)背側(cè)可以發(fā)育成骼肌組織，因此被稱為生皮肌節(jié)（Christ and Ordahl 1995, Daughters et al. 20

圖 3. 衛(wèi)星細(xì)胞異質(zhì)性分裂示意圖Fig 3. Schematic diagram of asymmetric division of satellite cells很多研究都表明了肌纖維的再生能力取決于衛(wèi)星細(xì)胞的增殖和分化能力以及自新能力。Collins 等人將新鮮完整的肌纖維移植到肌營養(yǎng)不良的小鼠骨骼肌部位發(fā)現(xiàn)供體小鼠的肌纖維移植后，肌纖維表面的衛(wèi)星細(xì)胞被激活并且開始大量增然后進(jìn)行肌源性分化形成新的肌纖維從而補(bǔ)充受體小鼠肌纖維的不足（Collins 005）。而在小鼠骨骼肌中特異消融 PAX7 陽性的衛(wèi)星細(xì)胞，骨骼肌纖維的再生能顯著抑制（Lepper et al. 2011）。Lepper 等人利用細(xì)胞標(biāo)記追蹤技術(shù)研究了 PAX星細(xì)胞參與的骨骼肌再生過程中的作用。Christoph Lepper 用 β-gal 標(biāo)記 PAX的衛(wèi)星細(xì)胞，并利用 CTX 對(duì)肌纖維進(jìn)行損傷，研究發(fā)現(xiàn)在肌纖維再生的過程中的肌纖維均為 β-gal 陽性，表明 PAX7 陽性細(xì)胞是骨骼肌再生過程中主要的細(xì)胞（Lepper et al. 2009）。Guitart 等人研究了在小鼠骨骼肌損傷過程中衛(wèi)星細(xì)胞的，發(fā)現(xiàn)在受損傷的骨骼肌中增殖狀態(tài)的 PAX7+衛(wèi)星細(xì)胞顯著增加，并且通過電

17圖 4.本研究的技術(shù)路線Fig 4 The scheme of this study2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本實(shí)驗(yàn)所用到的 C57/BL6 雌性小鼠（SPF 級(jí)）購自湖北省疾病預(yù)防控制中心。其中組織樣本來源于 10 個(gè)不同年齡的小鼠，即出生后 2 天（2 d）、8 天（8 d）、2 周（2 w）、4 周（4 w）、6 周（6 w）、8 周（8 w）、10 周（10 w）、12 周（12 w）、24周（24 w）以及 52 周（52 w）。我們從每個(gè)年齡段的小鼠的腿肌取三份組織樣品：兩份（全部腿肌組織樣）用液氮速凍，置于-80℃超低溫冰箱保存，用于后續(xù) Q-PCR和 Western blotting 的研究；一份（腓腸肌組織樣）保存在 4%多聚甲醛緩沖固定液中，用于免疫組織化學(xué)的研究。本實(shí)驗(yàn)用于分離衛(wèi)星細(xì)胞的小鼠腿肌樣本來源于 6個(gè)不同年齡的小鼠，即出生后 2 周（（2 w）、4 周（4 w）、6 周（6 w）、8 周（8 w）、

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本文編號(hào)：2746934