發(fā)布時間：2020-07-07 22:41

【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV)引起豬繁殖與呼吸綜合征,其特征是易感豬生殖健康狀況變差,死亡率升高,特別是在幼齡動物和呼吸系統(tǒng)疾病中。它是世界范圍內(nèi)豬肉生產(chǎn)國的重要疾病,導(dǎo)致母豬繁殖失敗和仔豬呼吸道疾病,這會導(dǎo)致區(qū)域性疾病的發(fā)生和慢性經(jīng)濟(jì)損失。GP5蛋白分子量約為25kDa,含有中和抗原表位,通常認(rèn)為中和抗體的產(chǎn)生與它密切相關(guān)。GP3是分子量約為28kDa的高度糖基化結(jié)構(gòu)蛋白,通常認(rèn)為它對可能影響蛋白的中和活性。該病毒具有已知最高的RNA病毒突變率之一,是開發(fā)保護(hù)性疫苗的主要障礙,DNA疫苗在疫苗生產(chǎn)中顯示了較好的應(yīng)用前景,可引起宿主產(chǎn)生體液免疫及細(xì)胞免疫的免疫應(yīng)答反應(yīng),以達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。本試驗以美洲型高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GD株GP3、GP5基因為研究對象,以pVAX1為載體,構(gòu)建重組核酸疫苗質(zhì)粒pVAX-N35HP,并對構(gòu)建的質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。將鑒定正確的核酸疫苗質(zhì)粒pVAX-N35HP與佐劑A1、A2、A3、A4、A8聯(lián)合使用,免疫分組為pVAX-N35HP+A1、pVAX-N35HP+A2、pVAX-N35HP+A3、pVAX-N35HP+A4和pVAX-N35HP+A8,對小鼠及健康仔豬的免疫效果進(jìn)行評價。實驗期間小鼠每周采血分離血清,檢測中和性抗體、GP3和GP5抗體、IL-4及IFN-γ水平;處死后分離脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量的檢測。結(jié)果表明,pVAX-N35HP+A3組中和性抗體滴度最高,達(dá)到1:16,與商品化滅活疫苗抗體滴度相同;pVAX-N35HP+A3組IL-4水平達(dá)到165.74 pg/μl,高于商品化滅活疫苗組;IFN-γ水平達(dá)到342.67 pg/μl,高于商品化滅活疫苗組;淋巴細(xì)胞亞群檢測結(jié)果顯示,pVAX-N35HP+A1組具有最高CD3~+CD4~+T淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù),為24.37%,略低于商品化滅活疫苗組;pVAX-N35HP組具有最高CD3~+CD8~+T淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù),達(dá)到45.21%,高于商品化滅活疫苗組T細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。表明pVAX-N35HP+A1、pVAX-N35HP+A2和pVAX-N35HP+A3可引起小鼠較強的細(xì)胞免疫和體液免疫,具有良好的免疫效果。選擇小鼠免疫效果較好的pVAX-N35HP+A1、pVAX-N35HP+A2和pVAX-N35HP+A3免疫仔豬,進(jìn)行豬體免疫效果評價。免疫后仔豬每周前腔靜脈采血,分離血清進(jìn)行中和性抗體和細(xì)胞因子等檢測,35天時無菌分離外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行T細(xì)胞亞類鑒定,同時準(zhǔn)備攻毒保護(hù)試驗,攻毒毒株為PRRSV GD株,攻毒劑量2×10~5TCID_(50)。攻毒后每天檢測仔豬直腸體溫,觀察仔豬健康狀態(tài),14天后剖殺豬只,采集心、肝、脾、肺、腎、腹股溝淋巴結(jié)和頜下淋巴結(jié)進(jìn)行病毒載量檢測,制作肺部組織病理切片。結(jié)果顯示,pVAX-N35HP+A1組和pVAX-N35HP+A3組具有最高的中和抗體滴度,達(dá)到1:18,低于商品化滅活疫苗組,但統(tǒng)計差異不顯著(p0.05);pVAX-N35HP+A1具有最高的IFN-γ水平,達(dá)到227.37 pg/μl,是pVAX-N35HP組1.22倍,但統(tǒng)計學(xué)差異不顯著(p0.05),高于商品化滅活疫苗組,統(tǒng)計學(xué)差異顯著(p0.05);pVAX-N35HP+A3組IL-4水平最高,為136.77 pg/μl,高于商品化滅活疫苗組,且統(tǒng)計學(xué)差異極顯著(p0.01);pVAX-N35HP+A1組CD3~+CD4~+T淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)為36.16%與商品化滅活疫苗組統(tǒng)計學(xué)無差異(p0.05);pVAX-N35HP+A3組CD3~+CD8~+T淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)達(dá)到62.37%,略高于商品化滅活疫苗組,統(tǒng)計學(xué)無差異(p0.05);攻毒后每日觀察仔豬狀態(tài),各免疫組體溫及健康狀態(tài)均好于陰性對照組;攻毒后14天,檢測組織內(nèi)病毒載量,肺部檢測結(jié)果顯示pVAX-N35HP+A1組最低,為2.14×10~3 copies/g,低于商品化滅活疫苗組,pVAX-N35HP組、pVAX-N35HP+A2組和pVAX-N35HP+A3組高于商品化滅活疫苗組但處于相同數(shù)量級。頜下淋巴結(jié)檢測結(jié)果顯示pVAX-N35HP+A1組最低,為7.25×10~3 copies/g,低于商品化滅活疫苗組。腹股溝淋巴結(jié)檢測結(jié)果顯示pVAX-N35HP+A1組最低,為8.70×10~3 copies/g,低于商品化滅活疫苗組。肺部病理切片結(jié)果顯示各免疫組肺部結(jié)構(gòu)均好于陰性對照組。pVAX-N35HP+A3可顯著提高仔豬體內(nèi)細(xì)胞免疫和體液免疫水平,強毒攻擊時顯示良好的保護(hù)效果,可作為預(yù)防和保護(hù)仔豬免受高致病性豬繁殖與呼吸綜合征的候選疫苗,為未來的疫苗研制提供參考。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S858.28
【圖文】：

優(yōu)化后（圖 2.1）蛋白親脂性相比優(yōu)化前（圖2.1A）更強，可能更有利于 GP3、GP5 蛋白的表達(dá)，密碼子優(yōu)化成功。圖 2.1 蛋白親水性分析Fig. 2.1 Protein hydrophilicity analysis1.3.2 重組質(zhì)粒 pVAX-N35HP 的構(gòu)建及酶切鑒定質(zhì)粒 pVAX-N35HP 構(gòu)建過程如圖 2.2，pVAX-N35HP 重組質(zhì)粒經(jīng) Xba I、HindIII 雙酶切，獲得 1 504 bp 的目的片段（圖 2.3）。測序驗證，重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。

圖 2.2 DNA 疫苗重組質(zhì)粒構(gòu)建過程示意圖Fig. 2.2 Construction of recombinant DNA vaccine圖 2.3 pVAX-N35HP 酶切結(jié)果A. λ—EcoT14 B. marker: DL2000 C. pVAX-N35HP 質(zhì)粒 XbaI+HindIII 酶切D. pVAX-N35HP 質(zhì)粒 HindIII 酶切

圖 2.3 pVAX-N35HP 酶切結(jié)果oT14 B. marker: DL2000 C. pVAX-N35HP 質(zhì)粒 XbaI+D. pVAX-N35HP 質(zhì)粒 HindIII 酶切Fig. 2.3 Enzyme-digestion result of pVAX-N35HPcoT14 B. marker: DL2000 C. pVAX-N35HP recombina Xba I+HindIII D. pVAX-N35HP recombinant plasmid enHindIII

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6 ;高致病性動物病原微生物實驗室生物安全管理審批辦法[N];農(nóng)民日報;2005年

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9 高彥生;馬來西亞半島發(fā)生高效致病性禽流感（續(xù)報6）[N];中國畜牧報;2004年

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