【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV)引起豬繁殖與呼吸綜合征,其特征是易感豬生殖健康狀況變差,死亡率升高,特別是在幼齡動物和呼吸系統(tǒng)疾病中。它是世界范圍內豬肉生產國的重要疾病,導致母豬繁殖失敗和仔豬呼吸道疾病,這會導致區(qū)域性疾病的發(fā)生和慢性經濟損失。GP5蛋白分子量約為25kDa,含有中和抗原表位,通常認為中和抗體的產生與它密切相關。GP3是分子量約為28kDa的高度糖基化結構蛋白,通常認為它對可能影響蛋白的中和活性。該病毒具有已知最高的RNA病毒突變率之一,是開發(fā)保護性疫苗的主要障礙,DNA疫苗在疫苗生產中顯示了較好的應用前景,可引起宿主產生體液免疫及細胞免疫的免疫應答反應,以達到預防和治療疾病的目的。本試驗以美洲型高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GD株GP3、GP5基因為研究對象,以pVAX1為載體,構建重組核酸疫苗質粒pVAX-N35HP,并對構建的質粒進行鑒定。將鑒定正確的核酸疫苗質粒pVAX-N35HP與佐劑A1、A2、A3、A4、A8聯(lián)合使用,免疫分組為pVAX-N35HP+A1、pVAX-N35HP+A2、pVAX-N35HP+A3、pVAX-N35HP+A4和pVAX-N35HP+A8,對小鼠及健康仔豬的免疫效果進行評價。實驗期間小鼠每周采血分離血清,檢測中和性抗體、GP3和GP5抗體、IL-4及IFN-γ水平;處死后分離脾淋巴細胞進行T淋巴細胞亞群數(shù)量的檢測。結果表明,pVAX-N35HP+A3組中和性抗體滴度最高,達到1:16,與商品化滅活疫苗抗體滴度相同;pVAX-N35HP+A3組IL-4水平達到165.74 pg/μl,高于商品化滅活疫苗組;IFN-γ水平達到342.67 pg/μl,高于商品化滅活疫苗組;淋巴細胞亞群檢測結果顯示,pVAX-N35HP+A1組具有最高CD3~+CD4~+T淋巴細胞百分數(shù),為24.37%,略低于商品化滅活疫苗組;pVAX-N35HP組具有最高CD3~+CD8~+T淋巴細胞百分數(shù),達到45.21%,高于商品化滅活疫苗組T細胞百分數(shù)。表明pVAX-N35HP+A1、pVAX-N35HP+A2和pVAX-N35HP+A3可引起小鼠較強的細胞免疫和體液免疫,具有良好的免疫效果。選擇小鼠免疫效果較好的pVAX-N35HP+A1、pVAX-N35HP+A2和pVAX-N35HP+A3免疫仔豬,進行豬體免疫效果評價。免疫后仔豬每周前腔靜脈采血,分離血清進行中和性抗體和細胞因子等檢測,35天時無菌分離外周血淋巴細胞進行T細胞亞類鑒定,同時準備攻毒保護試驗,攻毒毒株為PRRSV GD株,攻毒劑量2×10~5TCID_(50)。攻毒后每天檢測仔豬直腸體溫,觀察仔豬健康狀態(tài),14天后剖殺豬只,采集心、肝、脾、肺、腎、腹股溝淋巴結和頜下淋巴結進行病毒載量檢測,制作肺部組織病理切片。結果顯示,pVAX-N35HP+A1組和pVAX-N35HP+A3組具有最高的中和抗體滴度,達到1:18,低于商品化滅活疫苗組,但統(tǒng)計差異不顯著(p0.05);pVAX-N35HP+A1具有最高的IFN-γ水平,達到227.37 pg/μl,是pVAX-N35HP組1.22倍,但統(tǒng)計學差異不顯著(p0.05),高于商品化滅活疫苗組,統(tǒng)計學差異顯著(p0.05);pVAX-N35HP+A3組IL-4水平最高,為136.77 pg/μl,高于商品化滅活疫苗組,且統(tǒng)計學差異極顯著(p0.01);pVAX-N35HP+A1組CD3~+CD4~+T淋巴細胞百分數(shù)為36.16%與商品化滅活疫苗組統(tǒng)計學無差異(p0.05);pVAX-N35HP+A3組CD3~+CD8~+T淋巴細胞百分數(shù)達到62.37%,略高于商品化滅活疫苗組,統(tǒng)計學無差異(p0.05);攻毒后每日觀察仔豬狀態(tài),各免疫組體溫及健康狀態(tài)均好于陰性對照組;攻毒后14天,檢測組織內病毒載量,肺部檢測結果顯示pVAX-N35HP+A1組最低,為2.14×10~3 copies/g,低于商品化滅活疫苗組,pVAX-N35HP組、pVAX-N35HP+A2組和pVAX-N35HP+A3組高于商品化滅活疫苗組但處于相同數(shù)量級。頜下淋巴結檢測結果顯示pVAX-N35HP+A1組最低,為7.25×10~3 copies/g,低于商品化滅活疫苗組。腹股溝淋巴結檢測結果顯示pVAX-N35HP+A1組最低,為8.70×10~3 copies/g,低于商品化滅活疫苗組。肺部病理切片結果顯示各免疫組肺部結構均好于陰性對照組。pVAX-N35HP+A3可顯著提高仔豬體內細胞免疫和體液免疫水平,強毒攻擊時顯示良好的保護效果,可作為預防和保護仔豬免受高致病性豬繁殖與呼吸綜合征的候選疫苗,為未來的疫苗研制提供參考。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S858.28
【圖文】：

優(yōu)化后（圖 2.1）蛋白親脂性相比優(yōu)化前（圖2.1A）更強，可能更有利于 GP3、GP5 蛋白的表達，密碼子優(yōu)化成功。圖 2.1 蛋白親水性分析Fig. 2.1 Protein hydrophilicity analysis1.3.2 重組質粒 pVAX-N35HP 的構建及酶切鑒定質粒 pVAX-N35HP 構建過程如圖 2.2，pVAX-N35HP 重組質粒經 Xba I、HindIII 雙酶切，獲得 1 504 bp 的目的片段（圖 2.3）。測序驗證，重組質粒構建正確。

圖 2.2 DNA 疫苗重組質粒構建過程示意圖Fig. 2.2 Construction of recombinant DNA vaccine圖 2.3 pVAX-N35HP 酶切結果A. λ—EcoT14 B. marker: DL2000 C. pVAX-N35HP 質粒 XbaI+HindIII 酶切D. pVAX-N35HP 質粒 HindIII 酶切

圖 2.3 pVAX-N35HP 酶切結果oT14 B. marker: DL2000 C. pVAX-N35HP 質粒 XbaI+D. pVAX-N35HP 質粒 HindIII 酶切Fig. 2.3 Enzyme-digestion result of pVAX-N35HPcoT14 B. marker: DL2000 C. pVAX-N35HP recombina Xba I+HindIII D. pVAX-N35HP recombinant plasmid enHindIII

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