【摘要】：豬流行性腹瀉病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)屬于α冠狀病毒屬,是引起新生仔豬腹瀉的主要病因,每年給養(yǎng)豬業(yè)造成重大經濟損失。豬小腸上皮是PEDV感染的靶細胞,是由絨毛區(qū)和隱窩區(qū)組成的多種細胞類型的復雜結構。目前用于體外研究PEDV的細胞模型缺乏小腸上皮復雜的生理結構,限制了對PEDV的致病機理和調節(jié)宿主天然免疫應答的研究。因此,建立一個能模擬體內小腸上皮的細胞模型尤為必要。隨著干細胞技術的發(fā)展,體外培養(yǎng)的人或鼠腸類器官能模擬體內腸上皮結構。因此,本研究從豬不同腸段分離腸隱窩干細胞,其能夠在體外7天后分化成腸類器官,能重現腸上皮多種細胞類型的復雜結構,且能連續(xù)傳代和凍存復蘇。通過熒光定量PCR(qPCR)和間接免疫熒光(IFA)檢測發(fā)現小腸類器官對PEDV易感,能產生感染性病毒顆粒(TCID_(50)達10~4/mL)。IFA檢測證實PEDV可以感染多種類型的細胞(絨毛上皮細胞、干細胞和杯狀細胞)。進一步通過qPCR和IFA檢測,發(fā)現回腸類器官和結腸類器官表現出不同腸段對PEDV敏感性的差異,與體內結果一致,表明腸類器官保留著宿主遺傳特性。本研究還發(fā)現臨床分離株PEDV-JMS比細胞適應株PEDV CV777在回腸類器官中復制地更好。通過qPCR檢測發(fā)現PEDV在感染早期抑制回腸類器官中IFN產生,并且在回腸類器官中IFN-λ1比IFN-α誘導更強抗病毒基因的表達(ISG15、MxA、OASL和IFITM1),更有效抑制PEDV感染。Ⅲ型干擾素(IFN-λ)屬于IL-10家族成員,主要作用于黏膜上皮細胞。前期研究表明豬IFN-λ3比IFN-α更有效地抑制PEDV感染,但其抗病毒差異的機制尚不清楚,尤其是IFN-λ3誘導的轉錄譜,還未見報道。為解析豬IFN-λ3抗黏膜病毒的分子機制以及與IFN-α抗PEDV活性的差異,本文通過RNA-seq比較了兩種IFN在豬小腸上皮細胞(IPEC-J2)誘導的基因轉錄譜,發(fā)現IFN-λ3處理IPEC-J2細胞后誘導997個基因差異表達而IFN-α只誘導126個基因差異表達,其中共同誘導差異表達基因110個。轉錄譜富集分析表明,IFN-λ3比IFN-α參與調控IPEC-J2細胞中更多的細胞組分、分子功能等生物學過程,激活更多的信號通路,尤其是JAK-STAT信號通路。通過qPCR在IPEC-J2和小腸類器官上驗證了RNA-seq結果,證實IFN-λ3比IFN-α更有效上調ISGs表達(MX2、IFIT3、OASL、OAS1、RSAD2和PLAC8)。通過克隆表達IFN-λ3誘導前10個基因中的rsad2和mx2基因,證實豬RASD2和MX2呈劑量反應顯著抑制PEDV的感染。總之,本研究建立了一種可模擬體內腸上皮的腸類器官模型,為探索PEDV發(fā)病機制以及宿主與豬腸道病毒之間相互作用的體外研究提供了一個堅實的平臺,也為闡明IFN-λ抗PEDV的分子機制奠定了基礎。另外,通過對IFN-λ3和IFN-α誘導的轉錄譜分析及驗證為探索IFN在黏膜免疫中的抗病毒機制提供了理論依據。
【學位授予單位】：中國農業(yè)科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S858.28
【圖文】：

圖 1.1 PEDV 基因組和病毒粒子結構(Lee, 2015)Fig 1.1 PEDV genome organization and virion structure(Lee, 2015)3 PEDV 感染細胞模型前PEDV的復制和繁殖主要是在來源于非洲綠猴腎臟的Vero細胞上進行(Wangetal

圖 1.2 先天免疫信號通路和 PEDV 蛋白的拮抗作用(Koonpaew et al., 2019)Fig 1.2 Innate immune signaling pathways and antagonism by PEDV poteins(Koonpaew et al., 2019)2 腸類器官的研究進展

圖 1.3 腸類器官結構模型(Bartfeld, 2016)Fig 1.3 The model of enteroids(Bartfeld, 2016)器官模擬腸道上皮獨特的結構微環(huán)境為研究腸道病毒的各種生物學方面提供于人輪狀病毒（RV）來說，用于培養(yǎng) RV 的常規(guī)體外方法是在穩(wěn)定的細胞系中繁猴腎細胞（MA104）、人結直腸腺癌細胞（HT-29 和 Caco-2）或原代細胞系，

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本文編號：2743852