【摘要】：肌肉衛(wèi)星細(xì)胞是一種在肌肉發(fā)育過程中緊貼在骨骼肌細(xì)胞表面扁平有突起的肌源性干細(xì)胞,是發(fā)育生物學(xué)研究的重要內(nèi)容,在發(fā)育過程中會融合成多核肌管,最后形成肌纖維。本研究以牛肌肉衛(wèi)星細(xì)胞(Muscle-Derived Satellite Cells,MDSCs)為研究對象,通過體外培養(yǎng)、體外分化、蛋白免疫印跡、免疫熒光染色等實(shí)驗(yàn)技術(shù),檢測RanGTPase的激活蛋白RanGAP1(RanGTPase activating protein 1)在牛MDSCs體外分化過程中表達(dá)的變化,研究RanGAP1在過表達(dá)和低表達(dá)時(shí),對MDSCs體外分化過程的影響,探究RanGAP1在MDSCs體外分化過程中與PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路的關(guān)系,來探討RanGAP1對牛肌肉衛(wèi)星細(xì)胞分化的影響。具體實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及結(jié)果如下:(1)RanGAP1表達(dá)水平研究:通過牛MDSCs體外分化,收集分化0 d、1 d、2 d、3 d的蛋白樣,Western blot結(jié)果顯示,隨著體外分化時(shí)間的增加,RanGAP1的蛋白含量逐漸增加,MYOG的蛋白含量也逐漸增加。另外,通過免疫熒光染色分化0 d、1 d、3 d的體外分化的牛MDSCs,發(fā)現(xiàn)0 d沒有肌管形成,1 d開始出現(xiàn)小型肌管,3 d小型肌管開始融合,形成多核肌管。(2)RanGAP1的過表達(dá):通過CRISPR-dCas9技術(shù)構(gòu)建激活載體vpr+R3。轉(zhuǎn)染24h后,RanGAP1的蛋白含量增加,同時(shí)分化標(biāo)記因子(myogenin,MYOG)的含量也同時(shí)增加。免疫熒光染色結(jié)果顯示,vpr+R3組的肌管融合率明顯增高。(3)抑制RanGAP1的表達(dá):通過CRISPR-dCas9技術(shù)構(gòu)建抑制載體dcas9+R3,轉(zhuǎn)染24 h后,RanGAP1蛋白含量降低,同時(shí)MYOG的含量也降低。免疫熒光染色結(jié)果顯示,dcas9+R3組的肌管融合率明顯降低。(4)RanGAP1與PI3K/AKT信號通路的關(guān)系:牛MDSCs分化培養(yǎng)體系中加入PI3K抑制劑LY294002 24 h后檢測,顯示抑制劑組RanBP2、RanGAP1和MYOG的蛋白含量都下降。(5)RanGAP1與MAPK/ERK1/2信號通路的關(guān)系:牛MDSCs分化培養(yǎng)體系中加入MAPK/ERK抑制劑U0126 24 h后檢測,顯示抑制劑組RanBP2、RanGAP1和MYOG的含量都沒有明顯變化。結(jié)果表明:RanGAP1促進(jìn)牛MDSCs分化,在分化過程中受PI3K/AKT信號通路的調(diào)控,而不受MAPK/ERK1/2信號通路的影響。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S823
【圖文】：

圖 2-1 sgRNA Vector 質(zhì)粒圖譜[167]Fig. 2-1 sgRNA Vector map（2）酶切 sgRNA 表達(dá)載體按照以下酶切體系，用 Bbs I 酶去酶切 sgRNA 表達(dá)載體（見圖 2-1），酶切后的產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，切取所需載體條帶的膠塊，最后通過膠回收試劑盒回收含有粘性末端的 sgRNA表達(dá)載體。載體酶切見表 2-2。表 2-2 載體酶切體系Table 2-2 The reaction system of digestion of the vector成分 體積（μL）Bbs I 酶 110x 緩沖液 2sgRNA 載體 1加去離子水至 20（3）干擾片段引物退火按照以下退火體系，加入上下游引物，最后加入去離子水使終體積達(dá)到 50 μL，進(jìn)行退火

藍(lán)色是細(xì)胞核（200×）。is Desmin, blue is nucleus（200×）.圖 3-1 牛結(jié)蛋白免疫熒光染色Fig. 3-1 Immunofluorescence assay of Desmin牛 MDSCs 分化 1 d 后經(jīng)免疫熒光染色，Desmin 呈陽性。圖中顯示的in，藍(lán)色為 DAPI 染色的細(xì)胞核。Desmin 是 MDSCs 分化結(jié)構(gòu)肌管的主特異性標(biāo)志。經(jīng)免疫熒光染色后肌管呈綠色，表明分離的細(xì)胞為牛 MGAP1 在牛 MDSCs 分化不同時(shí)期中的表達(dá)nGAP1 蛋白表達(dá)化 0 d，1 d，2 d 和 3 d 的牛 MDSCs，用 Western Blot 實(shí)驗(yàn)檢測各時(shí)期1 和 MYOG 蛋白量的變化情況。件 ImageJ對反應(yīng)條帶進(jìn)行灰度掃描，計(jì)算 RanGAP1及 MYOG與內(nèi)參基出 RanGAP1 及 MYOG 蛋白在四個(gè)時(shí)期段的相對表達(dá)量結(jié)果，見圖 3

注：綠色是 RanGAP1，藍(lán)色是細(xì)胞核（200×）。Note: Green is RanGAP1, blue is nucleus（200×）.圖 3-3 免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測分化不同時(shí)期 RanGAP1 表達(dá)量Fig. 3-3 Immunofluorescence assay of RanGAP1 during bovine MDSCs differentiation結(jié)果顯示：牛 MDSCs 分化 0 d 的時(shí)候，沒有出現(xiàn)肌管；分化 1 d 時(shí)，有少量小型肌管；分化 3 d 時(shí)，出現(xiàn)多核大肌管。且分化過程中肌管的亮度也逐漸增加。由此可見，隨著牛 MDSCs的不斷分化，細(xì)胞的融合度逐漸增加，肌管中 RanGAP1 蛋白量逐漸升高。蛋白水平和形態(tài)方面可以得出，在牛 MDSCs 分化過程中，RanGAP1 含量逐漸增加。由此可見，RanGAP1 與牛 MDSCs 分化有一定的聯(lián)系。3.3 RanGAP1 對牛 MDSCs 分化的影響3.3.1 RanGAP1 過表達(dá)3.3.1.1 篩選 RanGAP1 過表達(dá)效率最高的載體通過 PEI 方法將 sgRNA，sgRNA-R1，sgRNA-R2，sgRNA-R3，sgRNA-R4 分別與 vpr 共同轉(zhuǎn)染牛 MDSCs，轉(zhuǎn)染 24 h 后，利用 Western Blot 實(shí)驗(yàn)檢測牛 MDSCs 中 RanGAP1 的蛋白

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 張偉偉;miR-2400和EGR1對牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化過程中MyoG基因表達(dá)調(diào)控[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

本文編號：2743827