【摘要】：多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida,Pm)是一種革蘭陰性條件致病菌,可感染多種家養(yǎng)或者野生動(dòng)物;根據(jù)莢膜抗原的特異性,可將其分為A、B、D、E和F 5個(gè)血清型。在我國牛群中,以往流行的主要是B型多殺性巴氏桿菌造成的出血性敗血癥;而自2006年以來,則主要是A型多殺性巴氏桿菌造成的多殺性巴氏桿菌肺炎,該病不僅嚴(yán)重威脅動(dòng)物健康,也給我國養(yǎng)殖業(yè)帶來較大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來,有文獻(xiàn)報(bào)道多殺性巴氏桿菌可以引起宿主的炎性介質(zhì)以及細(xì)胞凋亡等方面的免疫學(xué)改變,以及添加氨基酸,如谷氨酰胺(Gln)、脯氨酸(Pro)、精氨酸(Arg)等,可增強(qiáng)宿主抵抗多殺性巴氏桿菌感染的能力。但到目前為止,對牛源A型多殺性巴氏桿菌致病機(jī)制及其與宿主相互作用機(jī)制尚不清楚。因此,為了研究多殺性巴氏桿菌-宿主相互作用機(jī)制,本研究首先利用LD_(50) A型多殺性巴氏桿菌(PmCQ2)感染小鼠,建立小鼠多殺性巴氏桿菌肺炎模型;然后,利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對感染組與未感染組的小鼠肺組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序;同時(shí),利用GO注釋與KEGG數(shù)據(jù)庫對測序結(jié)果中的差異表達(dá)基因(DEGs)進(jìn)行分析與注釋,從宿主免疫反應(yīng)和氨基酸代謝角度分析DEGs所在富集通路并進(jìn)行驗(yàn)證,旨在了解多殺性巴氏桿菌感染小鼠后,其肺組織中的免疫學(xué)變化及氨基酸代謝變化,為研究多殺性巴氏桿菌與宿主之間的相互作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。1.小鼠多殺性巴氏桿菌肺炎模型的建立為了建立多殺性巴氏桿菌肺炎模型,本研究利用LD_(50) A型多殺性巴氏桿菌(PmCQ2)腹腔注射小鼠,觀察小鼠死亡情況;同時(shí),利用熒光原位雜交(FISH)及梯度稀釋涂板檢測感染0h、8h、16h、24h時(shí)肺部細(xì)菌定殖量;利用HE染色檢測肺組織炎性病理變化。結(jié)果顯示,PmCQ2對小鼠具有高致死性;通過稀釋涂板發(fā)現(xiàn)肺組織中細(xì)菌定殖量隨時(shí)間呈顯著性上升趨勢;通過FISH試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PmCQ2感染16h和24h時(shí),切片紅色熒光信號顯著性強(qiáng)于8h,但16h時(shí)的紅色熒光信號最強(qiáng);通過HE染色觀察發(fā)現(xiàn),PmCQ2引起小鼠肺組織強(qiáng)烈的炎性病變,主要表現(xiàn)為大量的以中性粒細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤。以上結(jié)果提示,由PmCQ2感染引起的小鼠多殺性巴氏桿菌肺炎模型建立成功。2.小鼠肺組織轉(zhuǎn)錄組測序以及質(zhì)量評估為了探索多殺性巴氏桿菌-宿主相互作用機(jī)制,本研究利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對PmCQ2感染組與未感染組的小鼠肺組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序;利用NGS QC Toolkit和Bowtie2或者Tophat(http://tophat.cbcb.umd.edu/)進(jìn)行質(zhì)控檢測及來樣本評估。結(jié)果顯示,clean reads數(shù)目可達(dá)5×10~7-7×10~7,有效堿基的百分比均在95%以上,基因組比對率基本在85%以上,GC含量均在49.5%-50.5%之間。以上結(jié)果提示,本研究中的轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量可信。3.從宿主免疫反應(yīng)角度分析及驗(yàn)證3.1 Th1、Th17通路中DEGs具有明顯的富集性為了探究PmCQ2感染后小鼠肺組織中的免疫反應(yīng),本研究分析從測序中DEGs在免疫反應(yīng)(Th1、Th2、Th17)中的富集情況。結(jié)果顯示,DEGs在Th1和Th17信號通路中呈明顯的富集性,并且大多在感染后呈顯著性上調(diào)。3.2 PmCQ2感染主要引起小鼠肺組織產(chǎn)生Th1免疫反應(yīng)為了進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組結(jié)果中Th1和Th17通路的富集性,本研究利用qRT-PCR驗(yàn)證Th1和Th17通路中的相關(guān)DEGs(Il6、Il23、Il17、Ifnγ和Tnfα);利用ELISA進(jìn)一步檢測IL6、IL17和IFNγ的分泌;利用western-blot檢測Th1和Th17信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子STAT1~(Tyr701)和STAT3~(Tyr705)的磷酸化水平。結(jié)果顯示,Th1和Th17通路中的相關(guān)細(xì)胞因子在感染后呈顯著性上調(diào),該結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致;并且,通路中關(guān)鍵細(xì)胞因子IL6、IL17和IFNγ在感染后也均呈顯著性上升;western-blot檢測到p-STAT1~(Tyr701)在PmCQ2感染后呈顯著性上升,p-STAT3~(Tyr705)在感染后有上升趨勢但不顯著。以上結(jié)果提示,經(jīng)多殺性巴氏桿菌感染后,小鼠肺組織中產(chǎn)生了強(qiáng)烈的Th1反應(yīng),而Th17反應(yīng)可能也有參與,但還需進(jìn)一步探究。4.從宿主氨基酸代謝角度分析及驗(yàn)證4.1多種氨基酸代謝通路中DEGs具有明顯的富集性為了探究宿主氨基酸代謝與多殺性巴氏桿菌感染的相關(guān)性,本研究分析測序中DEGs在氨基酸代謝通路中的富集程度;利用qRT-PCR驗(yàn)證富集通路中的關(guān)鍵DEGs。結(jié)果顯示,path:mmu00260(甘氨酸、蘇氨酸和絲氨酸代謝)、path:mmu00330(精氨酸代謝)、path:mmu00380(色氨酸代謝)、path:mmu00350(酪氨酸代謝)及path:mmu00250(天冬氨酸代謝)等5條代謝通路呈現(xiàn)明顯的DEGs富集;并且path:mmu00260和path:mmu00330中DEGs(Nos1、Nos2、Srm、Odc1、Smox、Aoc3、Shmt2、Gatm、Gamt和Phgdh)的qRT-PCR結(jié)果差異性均與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致。以上結(jié)果提示,氨基酸代謝可能參與了PmCQ2感染。4.2 PmCQ2感染引起小鼠肺組織中多種游離氨基酸變化為了探究PmCQ2感染過程中小鼠肺組織游離氨基酸變化,本研究檢測了小鼠肺組織中的游離氨基酸濃度。結(jié)果顯示,在PmCQ2感染后,小鼠肺組織中一共有10種呈顯著性下調(diào),主要包括path:mmu00260中的甘氨酸(Gly)、蘇氨酸(Thr)、絲氨酸(Ser),path:mmu00330中的Arg,path:mmu00350中的酪氨酸(Tyr)等。以上結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果可相互佐證,進(jìn)一步提示著氨基酸在多殺性巴氏桿菌感染過程中可能發(fā)揮著重要的作用。4.3 Gly、Thr、Ser均不直接影響PmCQ2在體外培養(yǎng)中的生長繁殖為了探究氨基酸是否直接作用于體外培養(yǎng)的多殺性巴氏桿菌,本研究利用不同濃度的Gly、Thr、Ser(path:mmu00260)添加到體外馬丁肉湯培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基培養(yǎng)的PmCQ2中,測定PmCQ2生長曲線。結(jié)果顯示,不同濃度的Gly、Thr、Ser均不影響不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的PmCQ2生長。該結(jié)果提示著,Gly、Thr、Ser均不直接作用于體外培養(yǎng)的PmCQ2。4.4在體外添加Gly、Thr、Ser可降低PmCQ2引起的巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)為了進(jìn)一步探究添加外源Gly、Thr、Ser對PmCQ2引起的巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)的影響,本研究利用LDH檢測添加不同濃度(0mM、1mM、5mM、10mM)Gly、Thr、Ser對細(xì)胞的毒性作用;選擇最佳濃度的氨基酸處理細(xì)胞2h后,感染PmCQ2 16h,檢測細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)上清中的細(xì)菌含量及炎性因子IL1β、IL17、TNFα和IFNγ的分泌情況。結(jié)果顯示,不同濃度的Gly、Thr、Ser均沒有造成細(xì)胞毒性,且本試驗(yàn)最佳濃度為10mM;Gly、Thr、Ser均不顯著性影響細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)上清中的細(xì)菌量;但添加Gly、Ser后,上清中炎性因子IL1β、IL17、TNFα和IFNγ均呈顯著性下調(diào),添加Thr后,TNFα和IL1β顯著性下調(diào),IL17和IFNγ的分泌沒有顯著性差異。以上結(jié)果提示,Gly、Thr、Ser并不影響細(xì)胞的吞噬能力,但可降低多殺性巴氏桿菌引起的巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)水平,并且添加Gly、Ser的作用強(qiáng)于添加外源Thr。4.5經(jīng)滴鼻添加Ser可降低PmCQ2引起的小鼠肺組織炎性反應(yīng)為了進(jìn)一步探究添加外源氨基酸對PmCQ2引起的動(dòng)物體內(nèi)炎性反應(yīng)的影響,本研究分別以滴鼻和肌肉注射Ser(0.1g/kg體重)的方式連續(xù)處理小鼠7d,腹腔感染PmCQ2,觀察死亡情況;利用qRT-PCR和ELISA檢測炎性因子IL1β、IL17、TNFα和IFNγ的表達(dá)和分泌情況。結(jié)果顯示,兩種途徑添加Ser后并沒有顯著性影響小鼠的存活率;肌肉注射Ser不影響肺組織炎性因子的產(chǎn)生,但滴鼻添加Ser后則顯著性下調(diào)了肺組織中炎性因子的表達(dá)和分泌。以上結(jié)果提示,滴鼻添加Ser后可降低多殺性巴氏桿菌引起的小鼠肺組織炎性反應(yīng)水平。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.61
【圖文】：

1.1 IL12的結(jié)構(gòu)及其與受體的相互作用[he structure and interaction of IL12 and theTAT1 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)早發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，因其能干擾病分為Ι型干擾素和ΙΙ型干擾素，前者是 IFNγ。天然 IFNγ 是由兩個(gè) 17kDa 的多肽賴于細(xì)胞表面的 IFNγ 受體。IFNγ IFNγ 受體 2(IFNGR2)。前者主要功能。由于具有活性的 IFNγ 是非以 2:2 結(jié)合的[53-56]。當(dāng) IFNγ 與 IF構(gòu)象發(fā)生改變，從而暴露 IFNG以此招募 JAK2，導(dǎo)致 JAK2 激酶發(fā)的 JAK1[57-59]。而 JAK1 磷酸化后會

自分泌途徑來源的 TGFβ[87]。TGFβ Thl 的產(chǎn)生。此外，有研究表明 TN7 細(xì)胞的分化[88]。Th17 細(xì)胞經(jīng)早期STAT3 又可直接結(jié)合分泌型 IL21 TAT3-Th17-IL21 的 IL21 自分泌環(huán) RORγt 的活化以及 IL17 產(chǎn)生，這個(gè)活與維持（穩(wěn)定階段）則需要另一12 相同的 IL12p40 亞基，以及特有缺失時(shí)，體內(nèi)的 Th17 細(xì)胞數(shù)量則顯 TGFβ/ IL21 均可誘導(dǎo) Th17 細(xì)胞表合后則可將信號進(jìn)一步傳遞到 Thl7子如 TNFα、IL1β、IL6 從而極大的增能力，明顯增加 IL17 水平[85]。值因子 IFNγ 和 IL4 均可抑制 Th17 細(xì)

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本文編號：2740161