發(fā)布時間：2020-07-03 15:13

【摘要】：雞傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)引起的禽免疫抑制病。IBDV靶向攻擊雞的中樞免疫器官法氏囊,破壞核心免疫細(xì)胞B淋巴細(xì)胞,不僅直接造成雞只死亡,耐過雞還呈現(xiàn)嚴(yán)重免疫抑制,降低機體免疫力,引起嚴(yán)重的并發(fā)和繼發(fā)感染,嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展。IBDV是一種具有雙節(jié)段雙鏈RNA基因組(A節(jié)段和B節(jié)段)的二十面體病毒。B節(jié)段編碼具有RNA依賴的RNA聚合酶活性(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)的VP1蛋白。A節(jié)段包含兩個部分重疊的開放閱讀框(Open reading frame,ORF),小ORF編碼VP5,大ORF編碼一個多聚蛋白(Polyprotein,PP)前體pVP2-VP4-VP3,該蛋白可被VP4反式酶解而釋放出pVP2和VP3,pVP2進(jìn)一步成熟為VP2。IBDV感染過程中,宿主天然免疫發(fā)揮重要的調(diào)控作用。FK506結(jié)合蛋白12(FK506 binding protein 12,FKBP12)是FKBPs家族的重要成員,具有肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶(Peptidyl-proly cis-trans isomerases,PPIase)活性等多種生理功能,也參與幾種人源病毒的感染調(diào)控。本實驗室前期的iTRAQ檢測數(shù)據(jù)提示,宿主FKBP12在IBDV感染時有明顯調(diào)動。本研究建立了宿主FKBP12熒光定量RT-PCR檢測方法,利用不同毒力的多種IBDV參考毒株,以SPF雞、DT40細(xì)胞為感染模型,從體內(nèi)、外兩個層面研究IBDV感染時宿主FKBP12的應(yīng)答性變化。體、內(nèi)外檢測結(jié)果均表明,FKBP12在IBDV強毒感染時下調(diào),弱毒感染時上調(diào)。這提示,FKBP12在IBDV感染過程中可能發(fā)揮重要調(diào)控作用。為證實這一推測,本研究分別運用過表達(dá)和siRNA干擾技術(shù)上調(diào)和下調(diào)FKBP12表達(dá),從基因轉(zhuǎn)錄水平、蛋白表達(dá)水平以及病毒滴度三個層面評估FKBP12對IBDV復(fù)制的影響。結(jié)果表明,FKBP12上調(diào)表達(dá)抑制IBDV復(fù)制,下調(diào)表達(dá)促進(jìn)病毒復(fù)制。這證明,FKBP12是IBDV感染的一個宿主限制性因子。為探索宿主FKBP12作為IBDV宿主限制性因子的作用分子細(xì)節(jié),本研究進(jìn)一步通過GST pull down和激光共聚焦試驗證實了雞源FKBP12與IBDV VP4蛋白存在相互作用。鑒于這兩個互作蛋白分別具有PPIase活性和絲氨酸蛋白酶活性,我們推測,FKBP12可能會通過影響VP4酶活性進(jìn)而抑制IBDV的復(fù)制�；贗BDV多聚蛋白(PP)被VP4反式酶解的研究模型,研究發(fā)現(xiàn),FKBP12過表達(dá)會抑制IBDV VP4蛋白對病毒PP蛋白的反式酶解,具體體現(xiàn)在源自PP酶解的VP2和VP3的下調(diào)。這說明,宿主FKBP12對IBDV的VP4反式酶解活性具有抑制作用。本研究從基因轉(zhuǎn)錄、蛋白表達(dá)、病毒滴度三個層面檢測了宿主蛋白FKBP12對IBDV復(fù)制的影響,鑒定了FKBP12是IBDV的一個新的宿主限制性因子。建立了宿主FKBP12熒光定量RT-PCR檢測方法,檢測了FKBP12在IBDV感染時的應(yīng)答變化:IBDV弱毒感染時,宿主限制性因子FKBP12被(宿主)上調(diào);IBDV強毒感染時,宿主限制性因子FKBP12被(病毒)下調(diào)。證明了宿主FKBP12與IBDV VP4蛋白存在相互作用,初步揭示了FKBP12通過抑制VP4反式酶解病毒多聚蛋白的蛋白酶活性進(jìn)而發(fā)揮宿主限制因子的作用。本研究對于探索IBD防控新制劑和新策略具有重要意義。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S858.31
【圖文】：

基因克��；B， 序列比對A, Gene cloning; B, Sequence analysis圖 2.1 雞源 FKBP12 基因的克隆及序列比對g. 2.1 Gene cloning and sequence analysis of chicken FKBP12因 RT-qPCR 檢測方法的建立片段（bp 81-261）克隆入 pMD18-T 載體，成功構(gòu)質(zhì)粒 pT-FKBP12-S。提純后，其濃度為 185.74 ng/ FKBP12 RT-qPCR 檢測方法的條件參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化熒光染料 10 μL，樣品 cDNA 2 μL，引物 FKBP去離子水補足至 20 μL。同時設(shè)置陰性對照（去離子8 ℃ 20s，72 ℃ 20s，45 個循環(huán)。溶解曲線程序為：粒檢測結(jié)果建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3.33，截距為，RT-qPCR 檢測反應(yīng)體系中標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)�？截悢�(shù)為 6

14A， 標(biāo)準(zhǔn)曲線；B， 敏感性分析；C， 特異性分析A, Standard curves; B, Sensitivity analysis; C, Specificity analysis圖 2.2 雞源 FKBP12 基因熒光定量 RT-PCR 檢測方法的建立Fig. 2.2 Establishment of a fluorescence quantitative RT-PCR assay for chicken FKBP12 g 感染對宿主 FKBP12 影響的體內(nèi)檢測結(jié)果 不同強毒感染對 FKBP12 影響的體內(nèi)檢測結(jié)果試驗一中， vvIBDV 中國參考株 HLJ0504、HuB-1、vvIBDV 歐洲參考株型致病性。與對照組相比，三個感染組均在感染后 48h（h p.i.）開始發(fā)病法氏囊開始萎縮。RT-qPCR 檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，在 48h p.i.和 7導(dǎo)致 FKBP12 下調(diào)（圖 2.3）。

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本文編號：2739833