【摘要】：豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是冠狀病毒科冠狀病毒屬的成員,引起的豬流行性腹瀉可使豬群出現(xiàn)腹瀉、嘔吐等癥狀,其中,1周齡仔豬發(fā)病較為嚴(yán)重,死亡率可達(dá)100%。最近幾年,PEDV再次出現(xiàn)爆發(fā)流行,世界各國均有報道,中國大部分省市豬群均有感染,給生豬養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失。此次PEDV的再次流行,與以往流行毒株相比,差異較大,出現(xiàn)了新的變異流行毒株,現(xiàn)有疫苗對其保護(hù)力差。因此,加強(qiáng)對新發(fā)變異毒株的研究,對PEDV的防控具有重要意義。本研究采集來自吉林省德惠市某豬場疑似PEDV感染致死的仔豬腸組織樣品,采用Vero E6細(xì)胞進(jìn)行病毒的分離培養(yǎng)。培養(yǎng)時采用添加胰蛋白酶的方法,成功分離到1株P(guān)EDV,并對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)和血清學(xué)鑒定,測定其TCID_(50)并進(jìn)行動物致病性試驗;對分離株的全基因序列進(jìn)行擴(kuò)增并測序,利用DNASTAR、MEGA 6.0等軟件將其與GenBank上已公布的參考序列進(jìn)行同源性比對分析,繪制遺傳進(jìn)化樹,分析其主要基因S、ORF3、M及N基因的序列特征。本研究中腸組織樣品經(jīng)無菌處理接種Vero E6細(xì)胞后,盲傳至第4代出現(xiàn)了細(xì)胞病變。病變表現(xiàn)為細(xì)胞變圓破碎和脫落,經(jīng)過形態(tài)學(xué)觀察和血清學(xué)鑒定,證明分離到的病毒為PEDV,暫命名為CH/JLDH/2016株;通過分子生物學(xué)納米巢式PCR的方法,證明分離株為變異毒株;傳至16代時,病毒含量較為穩(wěn)定,為10~(5.2) TCID_(50)/mL;通過動物致病性試驗,證明分離株對仔豬具有致病性。為了解該分離株的變異特點,本研究對CH/JLDH/2016株進(jìn)行了全基因擴(kuò)增和測序,并選取S、ORF3、M和N基因進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,S基因變異較為顯著,有16處的核苷酸插入和10處核苷酸的缺失,并且存在多處核苷酸突變,導(dǎo)致5個氨基酸插入和3個氨基酸缺失。在COE表位(499~638aa)有10處氨基酸改變,在SS6表位第766位氨基酸位點由Y變?yōu)镾。S、ORF3、M和N基因與NCBI上參考毒株同源性分別為93.6%~99.1%、91.3%~99.4%、97.4%~99.7%和95.7%~99.5%。基于S、M和N基因的遺傳進(jìn)化分析表明,該毒株與疫苗株均不處于同一分支,親緣關(guān)系較遠(yuǎn),與近幾年流行毒株遺傳距離較近;基于ORF3基因的遺傳進(jìn)化分析顯示,分離株雖與疫苗株CV777處于同一群,但分屬于不同亞群。對不同基因的遺傳進(jìn)化分析結(jié)果表明,該分離株主要結(jié)構(gòu)基因變異趨勢一致。上述研究結(jié)果提示,吉林省存在PEDV變異毒株的流行。本研究采用接毒時添加胰蛋白酶的方法,成功分離到了1株P(guān)EDV變異毒株,可在Vero E6細(xì)胞上穩(wěn)定傳代,并且對仔豬具有致病性,可為疫苗的研發(fā)提供候選毒株;通過對分離株主要基因的序列分析,有助于了解PEDV流行毒株的變異情況,豐富PEDV分子流行病學(xué)資料。
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.651
【圖文】：

集糞便或肛門拭子，進(jìn)行 PEDV PCR 檢測。.2.9.2 動物攻毒 7 日齡仔豬分為 2 組，每組 3 只。實驗組每只仔豬灌服細(xì)胞毒 25 mL照組每只灌服未接毒細(xì)胞培養(yǎng)物對照 25 mL。隔離飼養(yǎng)，每隔 12 h 觀察仔豬狀態(tài)，糞便或肛門拭子進(jìn)行 PCR 檢測。如有仔豬死亡或安樂死后，進(jìn)行剖檢，采集小腸組病理切片和免疫組化實驗，并進(jìn)行 PCR 檢測，收集小腸組織進(jìn)行病毒分離。1.3 結(jié)果.3.1 病毒分離培養(yǎng)結(jié)果將 PCR 檢測為陽性的腸組織病料處理液單層接種于 Vero E6 細(xì)胞后，從 2016 年吉德惠市某豬場采集的病死豬腸組織處理液分離到 1 株病毒，盲傳 4 代時出現(xiàn)明顯細(xì)胞，CPE 開始表現(xiàn)為細(xì)胞變圓，隨著時間增加，表現(xiàn)為細(xì)胞破碎，之后表現(xiàn)為細(xì)胞脫落照組細(xì)胞生長狀態(tài)良好，無病變現(xiàn)象，如圖 1.1。繼續(xù)進(jìn)行傳代，每代次病變達(dá)到 80間約為 35 h。

納米巢式 PCR 第 1 輪擴(kuò)增結(jié)果 B：納米巢式 PCR 第 2 輪擴(kuò)增結(jié)000 Marker；1：CH/JLDH/2016 分離株；2：PEDV 經(jīng)典毒株；3：圖 1.2 納米巢式 PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig1.2 Amplification results of nano-nest PCR結(jié)果觀察結(jié)果染后，在透射電子顯微鏡下觀察到了形態(tài)完整的病毒粒子粒子表面有花瓣狀纖突，病毒顆粒直徑（包含纖突部分）約

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2739018