【摘要】：鴨病毒性肝炎是由鴨肝炎病毒(DHV)引起雛鴨的一種急性、高致死性傳染病,發(fā)病急,傳播迅速,病程短和死亡率高;臨床表現(xiàn)為角弓反張,剖檢見(jiàn)肝腫大和大量的出血性斑點(diǎn),主要通過(guò)接觸傳播,經(jīng)呼吸道亦可感染。DHV分為3個(gè)血清型,即1型(DHV-1)、2型(DHV-2)和3型(DHV-3),其中DHV-1是主要血清型。該病是危害養(yǎng)鴨業(yè)最為嚴(yán)重的傳染病之一,在全國(guó)范圍內(nèi)都有不同程度的流行和發(fā)生,疫情較難控制,雖然鴨肝炎弱毒苗和滅活苗已在全國(guó)范圍內(nèi)大面積推廣,但在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中,免疫效果并不理想,鴨肝炎仍時(shí)有暴發(fā),給養(yǎng)鴨業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重危害,對(duì)于該病的控制仍舊得不到顯著改善。本研究通過(guò)對(duì)DHV-1 VP1基因的擴(kuò)增,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),獲得重組VP1蛋白表達(dá)產(chǎn)物;同時(shí)利用噬菌體展示技術(shù)以重組DHV-1 VP1蛋白為靶蛋白,通過(guò)噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù)篩選,結(jié)合ELISA鑒定和競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn),篩選到能與其特異性結(jié)合的多肽;以重組融合肽TP5-BP5(TBP5)配合DHV-1 VP1蛋白基因工程亞單位疫苗進(jìn)行雛鴨動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn),探討其對(duì)DHV-1 VP1蛋白亞單位疫苗的免疫增強(qiáng)作用。主要試驗(yàn)內(nèi)容分為以下三個(gè)方面:1、DHV-1 VP1基因的克隆及表達(dá)通過(guò)引物F1和F2對(duì)DHV-1 VP1基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳后得到約714 bp大小條帶,克隆到pET-32a載體,篩選重組表達(dá)質(zhì)粒,經(jīng)EcoR I與Xba I雙酶切和PCR進(jìn)行鑒定,獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pET32aVP1,并將重組質(zhì)粒pET32a-VP1轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析顯示,pET-32a(+)-VP1誘導(dǎo)后表達(dá)約43.0KD大小的目的蛋白條帶(包含TRX硫氧還蛋白),表明DHV-1 VP1基因在大腸桿菌中獲得了表達(dá)。Western-blot分析結(jié)果顯示,在43.0KD處可見(jiàn)特異性條帶,與預(yù)期結(jié)果一致,本研究為DHV-1VP1蛋白基因工程亞單位疫苗的制備提供實(shí)驗(yàn)材料。2、DHV-1 VP1蛋白特異性結(jié)合肽的篩選利用噬菌體展示技術(shù),并以DHV-1 VP1蛋白作為靶標(biāo)對(duì)噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù)進(jìn)行3輪親和篩選,獲得20個(gè)單個(gè)噬菌體克隆,結(jié)合ELISA鑒定和競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn),獲得與DHV-1 VP1蛋白特異性結(jié)合的陽(yáng)性噬菌體克隆P4與P6,提取其DNA進(jìn)行序列測(cè)定,結(jié)果顯示2個(gè)噬菌體陽(yáng)性克隆插入的12肽氨基酸序列分別為,P4-12:LLSPGTHHSPWP;P6-12:LLADTTHHRPWT,分析其保守序列為THHXPW。通過(guò)MTT法分析獲得DHV-1 VP1蛋白結(jié)合肽P4-12與P6-12本身對(duì)鴨胚成纖維細(xì)胞的增殖均無(wú)明顯影響,通過(guò)測(cè)定病毒滴度和病毒拷貝數(shù)結(jié)果表明P4-12和P6-12均能顯著降低鴨胚成纖維細(xì)胞中的DHV-1病毒滴度和病毒拷貝數(shù),表明多肽P4-12和P6-12顯著抑制DHV-1在鴨胚成纖維細(xì)胞中的增殖,為進(jìn)一步探明DHV-1與宿主細(xì)胞的相互作用以及抗病毒制劑開(kāi)發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)線索。3、重組融合肽TBP5對(duì)DHV-1 VP1蛋白亞單位疫苗的免疫增強(qiáng)作用將重組融合肽TBP5配合DHV-1 VP1蛋白亞單位疫苗,通過(guò)雛鴨的分組和免疫,通過(guò)檢測(cè)鴨體內(nèi)血清IgG抗體、血清細(xì)胞因子(INF-γ、IL-4)水平、動(dòng)物免疫保護(hù)試驗(yàn)及HE染色來(lái)評(píng)價(jià)重組融合肽TBP5對(duì)DHV-1 VP1蛋白亞單位疫苗的免疫增強(qiáng)作用。結(jié)果顯示,重組融合肽TBP5配合DHV-1 VP1蛋白亞單位疫苗組雛鴨血清IgG抗體水平、細(xì)胞因子(IL-4、IFN-γ)水平均顯著高于對(duì)照組與疫苗組。動(dòng)物免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示,重組融合肽TBP5配合DHV-1VP1蛋白亞單位疫苗免疫雛鴨后增強(qiáng)了對(duì)肝臟的保護(hù)作用,以上結(jié)果表明,重組融合肽TBP5對(duì)DHV-1 VP1蛋白亞單位疫苗具有免疫增強(qiáng)作用,為DHV-1VP1蛋白亞單位疫苗的新型佐劑研究奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：河南科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S858.32
【圖文】：

圖 2-1 DHV-1VP1 基因擴(kuò)增結(jié)果Figure 2-1 PCR amplification of DHV-1VP1 gen2：DHV-1 VP1 基因的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物；3：pET3雙酶切；4：DL 15000 Marker ； 克隆質(zhì)粒的構(gòu)建ET32a-VP1 轉(zhuǎn)入 E. coli BL 21(DE3)中進(jìn)行誘分析后，可見(jiàn)重組表達(dá)載體 pET32a-VP1白條帶，與預(yù)期結(jié)果相同（圖 2-2）。

圖 2-2 DHV-1VP1 在大腸桿菌中的表達(dá)Fig. 2-2 Expression of DHV-1 VP1 gene in E. coli BL2ker；2：大腸桿菌 BL21(重組質(zhì)粒 pET32a-VP1)誘ET32a)誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物；4：重組 VP1 蛋白 Westera)誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物 Western-blot，是由鴨肝炎病毒（DHV）引起雛鴨肝臟以傳播速度快，死亡率高為特征。本病的發(fā)，死亡率高達(dá) 95%；1-3 周齡的雛鴨的死亡精神萎靡，沒(méi)有食欲，眼半閉呈昏迷狀，腹現(xiàn)神經(jīng)癥狀，運(yùn)動(dòng)失調(diào)，行走困難；并且使和股部皮下水腫，絨尿液增多等癥狀，給

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 鄧艷文;;鴨病毒性肝炎的臨床特點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)室診斷與防治措施[J];現(xiàn)代畜牧科技;2017年02期

2 胡凱;郭慶;;中藥微生態(tài)制劑對(duì)鴨病毒性肝炎的防治效果[J];畜牧獸醫(yī)科技信息;2017年01期

3 李佳峗;和平;趙堅(jiān);陳里蘭;田建云;;德宏本地麻鴨幼鴨病毒性肝炎的發(fā)生與診治[J];畜禽業(yè);2016年12期

4 劉書懷;;鴨病毒性肝炎的防治要點(diǎn)[J];甘肅畜牧獸醫(yī);2016年23期

5 蓋如軍;王成達(dá);呂九云;;一例鴨病毒性肝炎的診治[J];吉林畜牧獸醫(yī);2016年12期

6 鄭昌江;;鴨病毒性肝炎的流行與防治[J];現(xiàn)代畜牧科技;2016年06期

7 崔楊;;鴨病毒性肝炎的流行特點(diǎn)及防治措施[J];現(xiàn)代畜牧科技;2016年05期

8 郭壯;楊士奇;;雛鴨病毒性肝炎的診療[J];畜牧獸醫(yī)科技信息;2016年02期

9 王雅平;;鴨病毒性肝炎的科學(xué)防治[J];中國(guó)畜禽種業(yè);2016年01期

10 姜曉明;遲曼;;鴨病毒性肝炎的診斷和中藥療法[J];當(dāng)代畜禽養(yǎng)殖業(yè);2016年01期

相關(guān)會(huì)議論文 前1條

1 王麗艷;付余;潘夢(mèng);張大丙;;鴨肝炎病毒的基因分型[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)禽病學(xué)分會(huì)第十四次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2008年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 李娟;胸腺素α1-胸腺五肽融合肽的制備、體內(nèi)外免疫調(diào)節(jié)與輔助抗腫瘤作用及與TLR2結(jié)合性質(zhì)研究[D];山東大學(xué);2013年

2 高德民;胸腺融合肽Tα1-TP5的表達(dá)、純化和活性研究[D];山東大學(xué);2009年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 武永杰;Ⅰ型鴨肝炎病毒VP1基因的克隆及其結(jié)構(gòu)蛋白的生物學(xué)特性預(yù)測(cè)[D];福建農(nóng)林大學(xué);2008年

本文編號(hào)：2739001