【摘要】：研究牛精子發(fā)生過程中的DNA甲基化,尋找與精子發(fā)生相關(guān)的基因,結(jié)合干細(xì)胞的體外培養(yǎng)與誘導(dǎo),建立體外誘導(dǎo)干細(xì)胞分化形成功能性生殖細(xì)胞的完整體系,從而推進(jìn)畜禽遺傳育種、品種改良以及轉(zhuǎn)基因品種的培育。精子發(fā)生包括有絲分裂、減數(shù)分裂和精子形成三個階段,該過程中DNA甲基化起重要作用。DNA甲基化的正常表達(dá)調(diào)控精子的正確發(fā)生,而其異常表達(dá)則造成精子功能的異常。本研究通過激光顯微切割技術(shù)獲取牛精子發(fā)生過程中四種不同類型的細(xì)胞,研究精子發(fā)生過程中DNA甲基化的變化,篩選功能性基因;在體外成功分離培養(yǎng)和鑒定牛睪丸間充質(zhì)干細(xì)胞,并使用維甲酸(Retinoic Acid,RA)誘導(dǎo)其向減數(shù)分裂前期分化,旨在鑒定體外誘導(dǎo)牛睪丸間充質(zhì)干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化的可行性。通過激光顯微切割系統(tǒng),成功獲取精原干細(xì)胞、初級精母細(xì)胞、圓形精子細(xì)胞和長形精子細(xì)胞,進(jìn)行單細(xì)胞全基因組甲基化測序分析。研究結(jié)果表明,精子發(fā)生過程中DNA甲基化水平呈動態(tài)變化:精原干細(xì)胞到初級精母細(xì)胞呈高甲基化趨勢;初級精母細(xì)胞到圓形精子細(xì)胞則是高甲基化與低甲基化交叉出現(xiàn);圓形精子細(xì)胞到長形精子細(xì)胞則再次表現(xiàn)出高甲基化狀態(tài),揭示DNA甲基化對精子發(fā)生過程具有調(diào)控作用。差異甲基化區(qū)域(Differentially methylated regions,DMR)相關(guān)基因篩選發(fā)現(xiàn),DNA水平差異最明顯的初級精母細(xì)胞與精原干細(xì)胞組中存在16134個差異基因,圓形精子細(xì)胞與初級精母細(xì)胞對比組中存在91個DMR相關(guān)基因;長形精子細(xì)胞與圓形精子細(xì)胞對比組中存在97個DMR相關(guān)基因。其中,初級精母細(xì)胞與精原干細(xì)胞組存在多種泛素-蛋白連接酶相關(guān)基因(TRI11、SH3R1、ZNRF1、MARH8)和組蛋白-賴氨酸-甲基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)的基因(KMT2C、EHMT1、SMYD3、NSD3),表明在精子發(fā)生過程中泛素-蛋白連接酶可能發(fā)揮重要作用,且DNA甲基化與組蛋白修飾保持密切聯(lián)系。DMR相關(guān)基因KEGG分析表明,初級精母細(xì)胞與精原干細(xì)胞對比組間,Rap1信號通路在調(diào)節(jié)生殖細(xì)胞-支持細(xì)胞粘附中具有重要作用,可能是精子發(fā)生過程中重要的信號通路。體外成功分離培養(yǎng)牛睪丸間充質(zhì)干細(xì)胞,RT-PCR鑒定該細(xì)胞表達(dá)CD105、CD166,流式細(xì)胞分析鑒定該細(xì)胞表達(dá)CD44、CD90、CD166且陽性率均在98%以上;克隆形成能力鑒定表明該細(xì)胞在體外具備自我更新的潛能;成功誘導(dǎo)為脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞,表明該細(xì)胞在體外具備多向分化潛能;并使用RA誘導(dǎo)該細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂階段。因此可以選取牛睪丸間充質(zhì)干細(xì)胞為研究對象,結(jié)合篩選獲取的差異基因,在體外研究其向生殖細(xì)胞的誘導(dǎo)分化,為建立完整的體外誘導(dǎo)干細(xì)胞分化形成生殖細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S823
【圖文】：

學(xué)位論文 過程 (Ehmcke et al., 2005)。中涉及兩次連續(xù)的減數(shù)分裂：第一次減數(shù)分裂完成后，形成次級后，形成單倍體圓形精子細(xì)胞 (Soh et al., 2017)。單倍體圓形精態(tài)發(fā)育形成不同長度的精子細(xì)胞和成熟的精子 (Western et al., 20，細(xì)胞核極化至細(xì)胞的一側(cè)，形成精子的頭部形狀，同時鞭毛形ll, 2015)。小鼠精子發(fā)生在每個睪丸內(nèi)的生精小管中，圖 1.1 展示分化為精子與支持細(xì)胞的密切營養(yǎng)和結(jié)構(gòu)有著極為重要的關(guān)系，細(xì)胞之間以及支持細(xì)胞和生殖細(xì)胞之間所需的蛋白質(zhì)復(fù)合物017)。

圖 1.2 小鼠睪丸曲細(xì)精管截面圖 (Borg et al., 2010)e 1.2 Cross-stional view of the seminiferous tubule of the mouse testis (Borg et al生過程中的 DNA 甲基化過程中的 DNA 甲基化化是哺乳動物重要的表觀遺傳標(biāo)記，這種標(biāo)記的正確分布依賴于 D維護(hù)機(jī)制 (Laisne et al., 2018)。DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶 1（Dnmt1）置為精原細(xì)胞，而 DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶 3a（Dnmt3a）以及 DNA 表達(dá)于精母細(xì)胞和圓形精子細(xì)胞 (徐晨等, 2014)。研究表明，從移酶 1（Dnmt1）的表達(dá)終止 (Sakai et al., 2001)，而 Dnmt1 的表達(dá)成后再次達(dá)到最高水平，表明 Dnmt1 在精子發(fā)生過程中 DNA 甲006)。Dnmt1 的缺失不能維持已獲得的 DNA 甲基化水平，導(dǎo)致整的錯誤表達(dá)，造成精原細(xì)胞的凋亡及早期胚胎死亡 (Li et al., 199 或者 Dnmt3b 的胚胎中，該胚胎不再具備從頭甲基化的能力，結(jié)1; Okano et al., 1999)。精子發(fā)生過程中，與其他位置的體細(xì)胞相甲基化狀態(tài)，睪丸 DNA 甲基化的狀態(tài)非常明顯，相當(dāng)于八倍體

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本文編號：2736092