【摘要】：研究牛精子發(fā)生過程中的DNA甲基化,尋找與精子發(fā)生相關的基因,結合干細胞的體外培養(yǎng)與誘導,建立體外誘導干細胞分化形成功能性生殖細胞的完整體系,從而推進畜禽遺傳育種、品種改良以及轉基因品種的培育。精子發(fā)生包括有絲分裂、減數(shù)分裂和精子形成三個階段,該過程中DNA甲基化起重要作用。DNA甲基化的正常表達調控精子的正確發(fā)生,而其異常表達則造成精子功能的異常。本研究通過激光顯微切割技術獲取牛精子發(fā)生過程中四種不同類型的細胞,研究精子發(fā)生過程中DNA甲基化的變化,篩選功能性基因;在體外成功分離培養(yǎng)和鑒定牛睪丸間充質干細胞,并使用維甲酸(Retinoic Acid,RA)誘導其向減數(shù)分裂前期分化,旨在鑒定體外誘導牛睪丸間充質干細胞向生殖細胞分化的可行性。通過激光顯微切割系統(tǒng),成功獲取精原干細胞、初級精母細胞、圓形精子細胞和長形精子細胞,進行單細胞全基因組甲基化測序分析。研究結果表明,精子發(fā)生過程中DNA甲基化水平呈動態(tài)變化:精原干細胞到初級精母細胞呈高甲基化趨勢;初級精母細胞到圓形精子細胞則是高甲基化與低甲基化交叉出現(xiàn);圓形精子細胞到長形精子細胞則再次表現(xiàn)出高甲基化狀態(tài),揭示DNA甲基化對精子發(fā)生過程具有調控作用。差異甲基化區(qū)域(Differentially methylated regions,DMR)相關基因篩選發(fā)現(xiàn),DNA水平差異最明顯的初級精母細胞與精原干細胞組中存在16134個差異基因,圓形精子細胞與初級精母細胞對比組中存在91個DMR相關基因;長形精子細胞與圓形精子細胞對比組中存在97個DMR相關基因。其中,初級精母細胞與精原干細胞組存在多種泛素-蛋白連接酶相關基因(TRI11、SH3R1、ZNRF1、MARH8)和組蛋白-賴氨酸-甲基轉移酶相關的基因(KMT2C、EHMT1、SMYD3、NSD3),表明在精子發(fā)生過程中泛素-蛋白連接酶可能發(fā)揮重要作用,且DNA甲基化與組蛋白修飾保持密切聯(lián)系。DMR相關基因KEGG分析表明,初級精母細胞與精原干細胞對比組間,Rap1信號通路在調節(jié)生殖細胞-支持細胞粘附中具有重要作用,可能是精子發(fā)生過程中重要的信號通路。體外成功分離培養(yǎng)牛睪丸間充質干細胞,RT-PCR鑒定該細胞表達CD105、CD166,流式細胞分析鑒定該細胞表達CD44、CD90、CD166且陽性率均在98%以上;克隆形成能力鑒定表明該細胞在體外具備自我更新的潛能;成功誘導為脂肪細胞和成骨細胞,表明該細胞在體外具備多向分化潛能;并使用RA誘導該細胞進入減數(shù)分裂階段。因此可以選取牛睪丸間充質干細胞為研究對象,結合篩選獲取的差異基因,在體外研究其向生殖細胞的誘導分化,為建立完整的體外誘導干細胞分化形成生殖細胞奠定基礎。
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S823
【圖文】：

學位論文 過程 (Ehmcke et al., 2005)。中涉及兩次連續(xù)的減數(shù)分裂：第一次減數(shù)分裂完成后，形成次級后，形成單倍體圓形精子細胞 (Soh et al., 2017)。單倍體圓形精態(tài)發(fā)育形成不同長度的精子細胞和成熟的精子 (Western et al., 20，細胞核極化至細胞的一側，形成精子的頭部形狀，同時鞭毛形ll, 2015)。小鼠精子發(fā)生在每個睪丸內的生精小管中，圖 1.1 展示分化為精子與支持細胞的密切營養(yǎng)和結構有著極為重要的關系，細胞之間以及支持細胞和生殖細胞之間所需的蛋白質復合物017)。

圖 1.2 小鼠睪丸曲細精管截面圖 (Borg et al., 2010)e 1.2 Cross-stional view of the seminiferous tubule of the mouse testis (Borg et al生過程中的 DNA 甲基化過程中的 DNA 甲基化化是哺乳動物重要的表觀遺傳標記，這種標記的正確分布依賴于 D維護機制 (Laisne et al., 2018)。DNA 甲基化轉移酶 1（Dnmt1）置為精原細胞，而 DNA 甲基化轉移酶 3a（Dnmt3a）以及 DNA 表達于精母細胞和圓形精子細胞 (徐晨等, 2014)。研究表明，從移酶 1（Dnmt1）的表達終止 (Sakai et al., 2001)，而 Dnmt1 的表達成后再次達到最高水平，表明 Dnmt1 在精子發(fā)生過程中 DNA 甲006)。Dnmt1 的缺失不能維持已獲得的 DNA 甲基化水平，導致整的錯誤表達，造成精原細胞的凋亡及早期胚胎死亡 (Li et al., 199 或者 Dnmt3b 的胚胎中，該胚胎不再具備從頭甲基化的能力，結1; Okano et al., 1999)。精子發(fā)生過程中，與其他位置的體細胞相甲基化狀態(tài)，睪丸 DNA 甲基化的狀態(tài)非常明顯，相當于八倍體

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本文編號：2736092