【摘要】：牛乳頭狀瘤(Bovine papillomatosis, BP)是由牛乳頭瘤病毒(Bovine papilloma-virus, BPV)引起腫瘤發(fā)生的慢性增生性疾病。本病無(wú)明顯的季節(jié)性和地區(qū)性,為奶牛最常見(jiàn)的腫瘤疾病,多發(fā)于體表、粘膜及某些器官。牛乳頭狀瘤易復(fù)發(fā),進(jìn)而發(fā)展為癌癥,導(dǎo)致動(dòng)物死亡,最終造成肉類(lèi)、奶業(yè)和皮革類(lèi)行業(yè)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,而目前尚無(wú)有效疫苗來(lái)預(yù)防牛乳頭瘤病的發(fā)生。E5蛋白是BPV的主要腫瘤蛋白,通過(guò)干擾細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和細(xì)胞周期調(diào)控來(lái)發(fā)揮作用,與生長(zhǎng)因子受體相互作用,激活細(xì)胞增殖。BPV E5蛋白參與細(xì)胞轉(zhuǎn)化,且在病毒感染初始以及整個(gè)過(guò)程中都有表達(dá),改變正常細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)因子的應(yīng)答,阻礙細(xì)胞表面主要組織相容性復(fù)合物的表達(dá)。鑒于這種種作用,E5具有被用來(lái)研發(fā)DNA疫苗的重大意義。因此,對(duì)于BPV相關(guān)功能蛋白的研究可為今后BPV疫苗的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。另外,隨著人類(lèi)性病中尖銳濕疣發(fā)病率的急速上升和宮頸癌、肛門(mén)癌等疾病的增多,HPV感染越來(lái)越引起人們的關(guān)注。BPV可以作為研究HPV感染,HPV與宿主以及與環(huán)境因素之間的相互作用關(guān)系的體內(nèi)模型,能夠?yàn)槿巳轭^瘤病的檢測(cè)與治療提供理論依據(jù)。 本實(shí)驗(yàn)克隆了牛乳頭瘤病毒13型海南株的全基因組,并構(gòu)建pEGFP-N1-E5重組真核表達(dá)載體,在HEK293細(xì)胞中表達(dá)。利用熒光觀察、FCM (Flow Cytometry Method)檢測(cè)和Western blot鑒定來(lái)驗(yàn)證重組蛋白的表達(dá),為牛乳頭瘤病的預(yù)防性和治療性疫苗的研發(fā)奠定了前期基礎(chǔ)。以下為本實(shí)驗(yàn)的研究方法和主要結(jié)果：1.牛乳頭瘤病毒基因分型與全基因組的克隆 本研究以來(lái)自�？谀侈r(nóng)場(chǎng)黃牛的牛乳頭瘤病料組織為材料,提取病毒DNA。根據(jù)乳頭瘤病毒衣殼蛋白L1基因的保守序列設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物FAP59/FAP64進(jìn)行PCR檢測(cè),經(jīng)過(guò)測(cè)序和序列比對(duì)對(duì)該BPV進(jìn)行了基因分型。結(jié)果顯示,患病黃牛所感染的BPV類(lèi)型為BPV-13,命名為BPV-13-HN。 設(shè)計(jì)BPV-13-HN基因型特異性引物,通過(guò)擴(kuò)增、測(cè)序、拼接、對(duì)比后獲得BPV13-HN全基因組序列。實(shí)驗(yàn)病毒株基因組全長(zhǎng)7961bp,包括8個(gè)開(kāi)放閱讀框(open reading frame, ORF),分別為早期基因區(qū)E1、E2、E4、E5、E6、E7和晚期基因區(qū)L1、L2。 2. BPV-13-HNE5蛋白在HEK293細(xì)胞中的表達(dá) 用PCR擴(kuò)增E5基因,以pEGFP-Nl為真核表達(dá)載體構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染進(jìn)入HEK293細(xì)胞。進(jìn)行熒光顯微觀察,流式細(xì)胞儀檢測(cè)和Western Blot鑒定。結(jié)果表明：本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了重組真核表達(dá)質(zhì)粒,可成功表達(dá)E5蛋白,為下一步穩(wěn)定表達(dá)E5的細(xì)胞系的構(gòu)建做好初步準(zhǔn)備,為E5蛋白的研究及相關(guān)疫苗的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：海南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S852.65

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本文編號(hào)：2736077