【摘要】：非編碼RNA包括microRNAs,Long non-coding RNAs,以及Circular RNAs,是當(dāng)今生命科學(xué)領(lǐng)域中研究最熱門的一個(gè)分支。其中,目前研究最為普遍的是microRNAs。MicroRNAs是一類短小的、高度保守的、內(nèi)源性非編碼RNA,在骨骼肌的發(fā)育過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的調(diào)控作用。在本研究中,參考實(shí)驗(yàn)室對(duì)徐淮山羊骨骼肌microRNAs高通量測(cè)序的結(jié)果,結(jié)合RT-qPCR分析miR-487b-3p在徐淮山羊不同發(fā)育時(shí)期(胎羊時(shí)期、成年羊時(shí)期),不同組織(心、肝、脾、肺、腎、小腸、背最長肌、腿肌)的表達(dá)譜,并構(gòu)建miR-487b-3p過表達(dá)載體以及合成miR-487b-3p化學(xué)模擬物分別轉(zhuǎn)染成肌細(xì)胞(C2C12),研究其在骨骼肌肌生成過程中調(diào)控作用。此外,還對(duì)miR-487b-3p的靶基因IRS1進(jìn)行預(yù)測(cè)和功能探究。本研究內(nèi)容和主要結(jié)果如下:(1)利用miRBase,Targetscan數(shù)據(jù)庫對(duì)miR-487b-3p及其靶基因IRS1 3’UTR序列保守性進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)mi R-487b-3p成熟序列以及與IRS1 3’UTR結(jié)合區(qū)序列在山羊、人、小鼠、牛以及綿羊等物種間具有高度的序列保守性。(2)miR-487b-3p在徐淮山羊不同發(fā)育階段(胎羊時(shí)期、成年羊時(shí)期)、不同組織中都廣泛表達(dá),miR-487b-3p在胎羊和成年羊肌肉組織的表達(dá)量高于其他組織,且miR-487b-3p在徐淮山羊胎羊肌肉組織中的表達(dá)量顯著高于其在成年羊肌肉組織中的表達(dá)量,表明mi R-487b-3p屬于非肌肉特異性microRNA,且可能在肌肉發(fā)育過程中有著重要的調(diào)控作用。(3)將pcDNA3.1(+)-miR-487b-3p、miR-487b-3p mimics、negative control(NC)、miR-487b-3p inhibitors、anti-negative control(anti-NC)轉(zhuǎn)染至C2C12細(xì)胞,分別過表達(dá)miR-487b-3p或者抑制miR-487b-3p表達(dá)。經(jīng)RT-qPCR和Western blot實(shí)驗(yàn)探究過表達(dá)miR-487b-3p或抑制miR-487b-3p表達(dá)對(duì)C2C12成肌細(xì)胞增殖、分化的影響;此外,結(jié)合CCK-8和EdU實(shí)驗(yàn)共同探究miR-487b-3p對(duì)C2C12成肌細(xì)胞的影響。結(jié)果表明,miR-487b-3p抑制成肌細(xì)胞(C2C12)的增殖和分化。(4)成功構(gòu)建了miR-487b-3p 3個(gè)靶基因IRS1、ITGA6、ZMYND8的野生型和突變型熒光素酶報(bào)告基因載體。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證明miR-487b-3p可以靶向作用于IRS1、ITGA6和ZMYND8 3’UTR區(qū)�；谏镄畔W(xué)(David、KEGG)分析、RT-qPCR和Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):miR-487b-3p抑制IRS1的表達(dá)。(5)通過RNAi實(shí)驗(yàn),結(jié)合Western blot、EdU進(jìn)一步探究發(fā)現(xiàn),抑制IRS1表達(dá)會(huì)抑制C2C12成肌細(xì)胞增殖、分化,與過表達(dá)miR-487b-3p趨勢(shì)一致。(6)IRS1在將信號(hào)從胰島素或胰島素樣生長因子受體傳遞至MAPK/ERK和PI3K/AKT信號(hào)通路的過程中起關(guān)鍵作用;實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示了mi R-487b-3p調(diào)控骨骼肌肌生成的機(jī)制,即miR-487b-3p通過作用IRS1,參與MAPK/ERK和PI3K/AKT通路的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),進(jìn)而對(duì)骨骼肌成肌細(xì)胞增殖、分化產(chǎn)生影響。
【學(xué)位授予單位】：江蘇師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S827
【圖文】：

江蘇師范大學(xué)碩士學(xué)位論文II 的抑制作用，進(jìn)而促進(jìn)骨骼肌的肌生成；PI3K 介導(dǎo)的 PI3K/AKT/mTOR/p70S6K信號(hào)通路在骨骼肌肌纖維形成過程中也有著重要的調(diào)控的作用[37-38]。IGF-I—MAPK 信號(hào)通路，PI3K—AKT 信號(hào)通路，AKT—mTOR—p70S6K 信號(hào)通路在調(diào)控肌肉發(fā)育過程中的作用[39]（如圖 1-1 所示）。

1.2.1 microRNAs 的形成機(jī)制microRNAs 的生物發(fā)生起始于基因組 DNA，由 RNA 聚合酶 II 將 miRNA 基因轉(zhuǎn)錄成含有 5’“帽子”和 3’多聚 A（polyA）“尾巴”結(jié)構(gòu)的 miRNA 的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物（pri-miRNA）[43]；隨后，初級(jí)轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過 Drosha 酶（RNA 核酸內(nèi)切酶）和其他輔助因子的“切割”作用下，形成 60-70 nt 的小發(fā)卡 RNA，即前體 miRNA（pre-miRNA）；接著，前體 miRNA 通過依靠三磷酸鳥苷蛋白（ran-GTP），由轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Exportin-5）將其從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中[44-45]。位于細(xì)胞質(zhì)中前體 miRNA經(jīng)過 Dicer 酶和雙鏈結(jié)合蛋白（TRBP）的共同作用下，形成 20-24 nt 的雙鏈 RNA（dsRNA）；隨后，根據(jù)熱力學(xué)穩(wěn)定性以及解旋酶的作用下，來源于 dsRNA 的兩條不同的成熟 miRNA 首先有一條 miRNA 在 AGO 蛋白參與下具備靶基因識(shí)別能力的 RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC），發(fā)揮其相應(yīng)的功能；而另一條成熟的 miRNA通常則會(huì)被降解[46-48]（如圖 1-2 所示）。

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本文編號(hào)：2735908