【摘要】：非洲豬瘟 ASF(African swine fever),是由非洲豬瘟病毒 ASFV(African swine fever virus)引起的家豬及野豬高死亡率的一種疾病。ASFV是大型雙鏈DNA病毒,長(zhǎng)約180 kb,編碼蛋白多達(dá)180個(gè)。ASFV主要通過(guò)接觸傳播,短距離內(nèi)也可通過(guò)空氣傳播,感染豬肺泡巨噬細(xì)胞引起家豬及野豬急性高熱癥狀。目前,ASFV現(xiàn)已傳播至中國(guó)大部分省市,造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。迄今為止,尚無(wú)有效的ASFV疫苗,重組腺病毒載體疫苗能夠誘導(dǎo)堅(jiān)強(qiáng)的細(xì)胞免疫及體液免疫應(yīng)答,且安全性更高。因此,本研究旨在制備表達(dá)多種ASFV保護(hù)性抗原的重組腺病毒載體,為研究ASF重組腺病毒載體疫苗提供借鑒。EP153R(EP153R)、CD2v(EP402R)、p54(E183L)和 p72(B646L)蛋白在 ASFV 復(fù)制、包裝等過(guò)程中均具有重要作用,是ASFV重要的保護(hù)性抗原。以EGFP為標(biāo)簽蛋白,構(gòu)建pShuttle-EGFP-EP 1 53R-EP402R、pShuttle-EGFP-EP153R-E183L 和 pShuttle-EGFP-B646L;為提高免疫效果,以CTLA4部分序列為先導(dǎo)序列,構(gòu)建pShuttle-CTLA4-EP 153R-EP402R、pShuttle-CTLA4-EP153R-E183L 和 pShuttle-CTLA4-B646L,構(gòu)建完成的載體分別轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞,western blot對(duì)融合蛋白表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證(pShuttle-CTLA4-B646L不表達(dá)),正確表達(dá)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BJ5183大腸桿菌重組菌株中,分別重組為pAd-EGFP/CTLA4-EP 153R-EP402R、pAd-EGFP/CTLA4-EP153R-E183L 和 pAd-EGFP-B646L 重組腺病毒載體,轉(zhuǎn)染 293A 細(xì)胞包裝重組腺病毒,重組腺病毒皮下注射小鼠進(jìn)行免疫,一免后7天進(jìn)行加強(qiáng)免疫,分別于一免后14d、30d、46d采血收集血清,使用原核表達(dá)產(chǎn)物EP153R蛋白及EGFP蛋白檢測(cè)血清中特異性抗體產(chǎn)生水平;一免后50d采集脾臟及腋下、腹股溝淋巴結(jié),使用原核表達(dá)蛋白EP153R與EGFP蛋白刺激淋巴細(xì)胞,分別檢測(cè)脾臟及淋巴結(jié)細(xì)胞增殖水平;同時(shí)使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)抗原刺激后CD3+細(xì)胞中IFN-γ+細(xì)胞比例,分析重組腺病毒免疫后小鼠對(duì)同種抗原的識(shí)別及反應(yīng)程度。結(jié)果表明:成功構(gòu)建的5種融合表達(dá)ASFV保護(hù)性抗原的重組腺病毒免疫小鼠后,均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性抗體,且CTLA4為佐劑的重組腺病毒免疫組能引起更好的體液免疫,EP153-CD2v 比EP153R-p54蛋白引起的體液免疫更強(qiáng),EGFP-p72蛋白引起的體液免疫反應(yīng)較弱;淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示,Ad-EGFP-p72免疫組淋巴細(xì)胞經(jīng)EGFP蛋白刺激后可增殖分化,其余免疫組經(jīng)EP153R刺激后無(wú)明顯增殖。流式結(jié)果與淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)相符,EGFP蛋白刺激Ad-EGFP-p72免疫組有特異性IFN-y分泌,其余組經(jīng)EP153R蛋白刺激后無(wú)明顯變化。
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.651
【圖文】：

性、高接觸性傳染病，即非洲豬瘟。非洲豬瘟臨床癥狀官出血、高死亡率為主要特征，目前無(wú)有效的疫苗用于對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失。該病屬于世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（Ｏ我國(guó)動(dòng)物病原微生物名錄中將其列為一類動(dòng)物疫病。逡逑學(xué)逡逑結(jié)構(gòu)逡逑型的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的病毒，病毒粒子呈二十面體對(duì)稱，平均核質(zhì)體、核衣殼、囊膜（分為外層與內(nèi)層）：核質(zhì)體主（ｐｌＯ、Ｐ１４、ｐ３７、ｐ３４及ｐｌ５０等）及基因早期轉(zhuǎn)錄所需白ｐ７２和ｐｌ７，由大約２０００個(gè)殼粒組成；內(nèi)側(cè)囊膜來(lái)源、ｐ３２、ｐ５４、及ＣＤ２ｖ蛋白，外層囊膜為病毒出芽附帶榦~=“二．灄譬逡逑

細(xì)胞鋪板及接毒過(guò)程如上所示，接毒５邋ｄ后棄去培養(yǎng)基，加入２００邋＾１４％多聚甲醛固定逡逑１５ｍｉｎ，棄去固定液，加入ＰＢＳＴ清洗２次，力口入－８０°Ｃ預(yù)冷的無(wú)水乙醇加固ｌＯｍｉｎ，邋ＰＢＳＴ逡逑清洗４次，加入５％邋ＢＳＡ封閉液室溫封閉２邋ｈ，ＰＢＳＴ清洗３次，加入１００邋＾丨按照丨：８00稀逡逑釋的ＨＡ—抗，４°Ｃ搖床孵育過(guò)夜，ＰＢＳＴ清洗５次，加入１００邋４邋１：２０００稀釋的熒光二抗，逡逑室溫孵育ｌｈ，邋ＰＢＳＴ清洗５次，熒光顯微鏡觀察熒光。逡逑１．３結(jié)果逡逑１．３．１目的片段ＰＣＲ擴(kuò)增逡逑分別在邋ＥＧＦＰ、ＥＰ１５３Ｒ、Ｅ１８３Ｌ、Ｂ６４６Ｌ、ＥＰ４０２Ｒ、ＣＴＬＡ４邋兩端通過(guò)邋ＰＣＲ邋增加修飾逡逑片段，便于載體構(gòu)建，ＰＣＲ修飾后大小分別為７７０邋ｂｐ、５２２邋ｂｐ、４１１邋ｂｐ、１９７２邋ｂｐ、１１３２邋ｂｐ、逡逑３９５邋ｂｐ，圖丨－１邋到圖邋１－６邋分別為邋ＥＧＦＰ、ＥＰ１５３Ｒ、Ｅ１８３Ｌ、Ｂ６４６Ｌ、ＥＰ４０２Ｒ、ＣＴＬＡ４邋片段，逡逑１％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示６個(gè)片段條帶單一且大小均符合預(yù)期。逡逑

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本文編號(hào)：2734686