【摘要】：非洲豬瘟 ASF(African swine fever),是由非洲豬瘟病毒 ASFV(African swine fever virus)引起的家豬及野豬高死亡率的一種疾病。ASFV是大型雙鏈DNA病毒,長約180 kb,編碼蛋白多達180個。ASFV主要通過接觸傳播,短距離內(nèi)也可通過空氣傳播,感染豬肺泡巨噬細胞引起家豬及野豬急性高熱癥狀。目前,ASFV現(xiàn)已傳播至中國大部分省市,造成了巨大的經(jīng)濟損失。迄今為止,尚無有效的ASFV疫苗,重組腺病毒載體疫苗能夠誘導(dǎo)堅強的細胞免疫及體液免疫應(yīng)答,且安全性更高。因此,本研究旨在制備表達多種ASFV保護性抗原的重組腺病毒載體,為研究ASF重組腺病毒載體疫苗提供借鑒。EP153R(EP153R)、CD2v(EP402R)、p54(E183L)和 p72(B646L)蛋白在 ASFV 復(fù)制、包裝等過程中均具有重要作用,是ASFV重要的保護性抗原。以EGFP為標簽蛋白,構(gòu)建pShuttle-EGFP-EP 1 53R-EP402R、pShuttle-EGFP-EP153R-E183L 和 pShuttle-EGFP-B646L;為提高免疫效果,以CTLA4部分序列為先導(dǎo)序列,構(gòu)建pShuttle-CTLA4-EP 153R-EP402R、pShuttle-CTLA4-EP153R-E183L 和 pShuttle-CTLA4-B646L,構(gòu)建完成的載體分別轉(zhuǎn)染 293T 細胞,western blot對融合蛋白表達進行驗證(pShuttle-CTLA4-B646L不表達),正確表達的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BJ5183大腸桿菌重組菌株中,分別重組為pAd-EGFP/CTLA4-EP 153R-EP402R、pAd-EGFP/CTLA4-EP153R-E183L 和 pAd-EGFP-B646L 重組腺病毒載體,轉(zhuǎn)染 293A 細胞包裝重組腺病毒,重組腺病毒皮下注射小鼠進行免疫,一免后7天進行加強免疫,分別于一免后14d、30d、46d采血收集血清,使用原核表達產(chǎn)物EP153R蛋白及EGFP蛋白檢測血清中特異性抗體產(chǎn)生水平;一免后50d采集脾臟及腋下、腹股溝淋巴結(jié),使用原核表達蛋白EP153R與EGFP蛋白刺激淋巴細胞,分別檢測脾臟及淋巴結(jié)細胞增殖水平;同時使用流式細胞儀檢測抗原刺激后CD3+細胞中IFN-γ+細胞比例,分析重組腺病毒免疫后小鼠對同種抗原的識別及反應(yīng)程度。結(jié)果表明:成功構(gòu)建的5種融合表達ASFV保護性抗原的重組腺病毒免疫小鼠后,均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性抗體,且CTLA4為佐劑的重組腺病毒免疫組能引起更好的體液免疫,EP153-CD2v 比EP153R-p54蛋白引起的體液免疫更強,EGFP-p72蛋白引起的體液免疫反應(yīng)較弱;淋巴細胞增殖實驗顯示,Ad-EGFP-p72免疫組淋巴細胞經(jīng)EGFP蛋白刺激后可增殖分化,其余免疫組經(jīng)EP153R刺激后無明顯增殖。流式結(jié)果與淋巴細胞增殖實驗相符,EGFP蛋白刺激Ad-EGFP-p72免疫組有特異性IFN-y分泌,其余組經(jīng)EP153R蛋白刺激后無明顯變化。
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.651
【圖文】：

性、高接觸性傳染病，即非洲豬瘟。非洲豬瘟臨床癥狀官出血、高死亡率為主要特征，目前無有效的疫苗用于對養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失。該病屬于世界動物衛(wèi)生組織（Ｏ我國動物病原微生物名錄中將其列為一類動物疫病。逡逑學(xué)逡逑結(jié)構(gòu)逡逑型的細胞內(nèi)復(fù)制的病毒，病毒粒子呈二十面體對稱，平均核質(zhì)體、核衣殼、囊膜（分為外層與內(nèi)層）：核質(zhì)體主（ｐｌＯ、Ｐ１４、ｐ３７、ｐ３４及ｐｌ５０等）及基因早期轉(zhuǎn)錄所需白ｐ７２和ｐｌ７，由大約２０００個殼粒組成；內(nèi)側(cè)囊膜來源、ｐ３２、ｐ５４、及ＣＤ２ｖ蛋白，外層囊膜為病毒出芽附帶榦~=“二．灄譬逡逑

細胞鋪板及接毒過程如上所示，接毒５邋ｄ后棄去培養(yǎng)基，加入２００邋＾１４％多聚甲醛固定逡逑１５ｍｉｎ，棄去固定液，加入ＰＢＳＴ清洗２次，力口入－８０°Ｃ預(yù)冷的無水乙醇加固ｌＯｍｉｎ，邋ＰＢＳＴ逡逑清洗４次，加入５％邋ＢＳＡ封閉液室溫封閉２邋ｈ，ＰＢＳＴ清洗３次，加入１００邋＾丨按照丨：８00稀逡逑釋的ＨＡ—抗，４°Ｃ搖床孵育過夜，ＰＢＳＴ清洗５次，加入１００邋４邋１：２０００稀釋的熒光二抗，逡逑室溫孵育ｌｈ，邋ＰＢＳＴ清洗５次，熒光顯微鏡觀察熒光。逡逑１．３結(jié)果逡逑１．３．１目的片段ＰＣＲ擴增逡逑分別在邋ＥＧＦＰ、ＥＰ１５３Ｒ、Ｅ１８３Ｌ、Ｂ６４６Ｌ、ＥＰ４０２Ｒ、ＣＴＬＡ４邋兩端通過邋ＰＣＲ邋增加修飾逡逑片段，便于載體構(gòu)建，ＰＣＲ修飾后大小分別為７７０邋ｂｐ、５２２邋ｂｐ、４１１邋ｂｐ、１９７２邋ｂｐ、１１３２邋ｂｐ、逡逑３９５邋ｂｐ，圖丨－１邋到圖邋１－６邋分別為邋ＥＧＦＰ、ＥＰ１５３Ｒ、Ｅ１８３Ｌ、Ｂ６４６Ｌ、ＥＰ４０２Ｒ、ＣＴＬＡ４邋片段，逡逑１％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示６個片段條帶單一且大小均符合預(yù)期。逡逑

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