【摘要】：山羊痘病毒(Goat pox virus, GTPV)、綿羊痘病毒(Sheep pox virus, SPPV)、牛疙瘩皮膚病病毒(Lumpy skin disease virus, LSDV)、傳染性膿皰病毒(Contagious ecthyma virus, CPDV)、藍(lán)舌病病毒(bluetongue virus, BTV)、小反芻獸疫病毒(peste des petits ruminants virus, PPRV)能引起反芻動(dòng)物急性、熱性傳染病,發(fā)病率高,危害嚴(yán)重。6種病毒中除傳染性膿皰病毒外,其余五種病毒均為OIE通報(bào)疫病病毒；我國(guó)農(nóng)業(yè)部將山羊痘、綿羊痘、牛疙瘩皮膚病、藍(lán)舌病、小反芻獸疫列為一類疫病,羊傳染性膿皰為三類疫病。此外,山羊痘、綿羊痘、傳染性膿皰亦是人畜共患傳染病,在危害畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失的同時(shí),對(duì)人類健康也構(gòu)成嚴(yán)重危害。目前,國(guó)內(nèi)未見(jiàn)牛疙瘩皮膚病流行的報(bào)道。由于這6種疫病均以皮膚、黏膜產(chǎn)生皰疹、潰瘍?yōu)橄嗨婆R床癥狀,常呈混合感染,僅從臨床癥狀上難以診斷與區(qū)分。傳統(tǒng)的診斷方法如病毒分離鑒定、血清學(xué)方法有操作繁瑣、耗時(shí)費(fèi)力、靈敏度低、假陽(yáng)性率高等不足,難以同時(shí)對(duì)多種病原進(jìn)行檢測(cè)。因此,應(yīng)臨床和口岸快速通關(guān)檢測(cè)需要,急需建立一種快速、準(zhǔn)確、靈敏、穩(wěn)定性好,且能同時(shí)鑒別診斷上述6種疫病病原的檢測(cè)方法。GeXP-PCR (Gene eXpress Profiler-polymerase chain reaction)是將通用引物與特異性嵌合引物按比例混合進(jìn)行PCR擴(kuò)增,由GeXP系統(tǒng)對(duì)經(jīng)染色標(biāo)記處理的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行片段長(zhǎng)度的測(cè)定的一種新技術(shù),具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、高通量等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)GeXP系統(tǒng)常用于基因表達(dá)分析、病毒檢測(cè)等領(lǐng)域的研究與運(yùn)用。本研究以山羊痘病毒、綿羊痘病毒、牛疙瘩皮膚病毒、傳染性膿皰病毒、藍(lán)舌病病毒、小反芻獸疫病毒為對(duì)象,優(yōu)化建立GeXP多重PCR檢測(cè)方法。該方法能同時(shí)對(duì)上述6種牛羊病毒性病原進(jìn)行鑒別檢測(cè),為山羊痘等6種疫病的鑒別診斷、疫情監(jiān)控、流行病學(xué)調(diào)查、出入境動(dòng)物檢疫等提供技術(shù)保障,對(duì)保障我國(guó)的畜牧業(yè)生產(chǎn)安全、人類健康具有十分重要的意義。主要研究?jī)?nèi)容與結(jié)果如下：(1)根據(jù)山羊痘病毒、綿羊痘病毒、牛疙瘩皮膚病毒、傳染性膿皰病毒、藍(lán)舌病病毒和小反芻獸疫病毒的保守序列設(shè)計(jì)了6對(duì)特異性引物,經(jīng)PCR擴(kuò)增、目的片段的克隆及測(cè)序,結(jié)果發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物與GenBank中各毒株的同源性都在97%以上,表明設(shè)計(jì)的6對(duì)特異性引物均能擴(kuò)增出目標(biāo)序列。(2)通過(guò)對(duì)特異性嵌合引物的引物濃度及退火溫度進(jìn)行優(yōu)化,分別建立6種牛羊病毒性病原的GeXP單重PCR體系,進(jìn)行單重GeXP-PCR的靈敏度試驗(yàn),并與OIE推薦方法進(jìn)行比較。結(jié)果表明,牛疙瘩皮膚病病毒、傳染性膿皰病毒的靈敏度為103copies/μL;山羊痘病毒、小反芻獸疫病毒、綿羊痘病毒和藍(lán)舌病病毒的靈敏度可達(dá)到102 copies/μL。可見(jiàn),GeXP單重PCR檢測(cè)方法具有較高的靈敏度,比OIE推薦方法的靈敏度(106～107copies/μL)高10000～100000倍。(3)建立并優(yōu)化6種牛羊病毒性病原GeXP多重PCR檢測(cè)體系,并進(jìn)行特異性、靈敏度試驗(yàn)。特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示,牛疙瘩皮膚病病毒、傳染性膿皰病毒、山羊痘病毒、小反芻獸疫病毒、綿羊痘病毒和藍(lán)舌病病毒均產(chǎn)生了清晰且與預(yù)期目標(biāo)片段大小相符的特異性擴(kuò)增峰,呈陽(yáng)性；其余的毒株均無(wú)非特異性擴(kuò)增,呈陰性,說(shuō)明本研究所建立的方法特異性良好。靈敏度檢測(cè)結(jié)果顯示,發(fā)現(xiàn)6種病原單管擴(kuò)增均能同時(shí)檢測(cè)到的靈敏度達(dá)104copies/μL。(4)用本研究建立的GeXP多重PCR檢測(cè)方法和OIE推薦的方法對(duì)模擬臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)。在制備的54份模擬樣品中,GeXP多重PCR檢測(cè)方法的陽(yáng)性率為94.87%,假陽(yáng)性率為6.67%,假陰性率為5.13%。在35份單獨(dú)感染的模擬樣本(除CPDV)及陰性樣本中,GeXP多重PCR檢測(cè)方法的陽(yáng)性率為95%,假陽(yáng)性率為6.67%%,假陰性率為5%；OIE推薦方法檢測(cè)的陽(yáng)性率為70%,假陽(yáng)性率為O%,假陰性為30%。結(jié)果表明,GeXP多重PCR檢測(cè)方法較大程度地提高了陽(yáng)性率并減小了假陰性率,可采用本研究建立的方法對(duì)臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)�？傊�,本研究建立的GeXP多重PCR,能同時(shí)檢測(cè)牛疙瘩皮膚病病毒、傳染性膿皰病毒、山羊痘病毒、小反芻獸疫病毒、綿羊痘病毒和藍(lán)舌病病毒,且特異性好、靈敏度高,為預(yù)防和監(jiān)控上述6種牛羊病毒性病原提供了一種快速、準(zhǔn)確、靈敏的診斷方法。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.65

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本文編號(hào)：2734575