【摘要】：本課題組前期對國內(nèi)外綿羊品種進行了全基因組重測序分析,篩選出了一些與綿羊尾型相關的基因,其中BMP2(骨形態(tài)發(fā)生蛋白2,bone morphogenetic protein 2)和PDGF-D(血小板源性生長因子D,Platelet-derived growth factor-D)受到強烈選擇。本試驗選擇BMP2和PDGF-D作為候選基因,進行分子水平和細胞水平驗證,旨在為綿羊尾部脂肪沉積的調(diào)控提供基礎研究資料,為分子育種提供可用的遺傳標記。選取藏羊、湖羊兩品種各30個個體的基因組樣本分別等量混池,擴增BMP2和PDGF-D所有外顯子及基因上下游1000 bp,使用飛行質(zhì)譜對檢測到的SNP位點進行基因分型,利用Haploview 4.1軟件進行連鎖不平衡分析,使用SAS 9.2軟件將多態(tài)位點與尾型性狀關聯(lián)分析。同時,從胎羊尾部脂肪組織中分離原代前體脂肪細胞,對其進行培養(yǎng)擴增獲得細胞水平驗證的原材料。利用慢病毒載體將BMP2和PDGF-D基因穩(wěn)定過表達于前體脂肪細胞中,用胰島素進行誘導分化,利用q PCR和WB(Western blot)方法對脂肪細胞分化過程中的標記基因脂蛋白脂酶(LPL)和過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)的表達量進行檢測。對成熟脂肪細胞油紅O染色觀察脂滴形成情況。得到以下結果:1)在BMP2基因下游發(fā)現(xiàn)3個突變位點:g.48401619 TA、g.48401272 CA、g.48401136 CT;在PDGF-D基因上游發(fā)現(xiàn)1個突變位點:g.3852134 CT,內(nèi)含子區(qū)發(fā)現(xiàn)1個位點:g.4122606CG。2)BMP2基因的g.48401619 TA、g.48401272 CA和g.48401136 CT位點與尾長呈顯著相關(P0.05);PDGF-D基因的g.4122606 CG位點與尾長顯著相關(P0.05),g.3852134 CT位點與尾寬顯著相關(P0.05)。3)BMP2基因的g.48401619 TA、g.48401272 CA和g.48401136 CT三個位點中,g.48401272CA和g.48401136 CT之間存在強連鎖。構成3種單倍型,6種組合基因型。其中CACT型和CCCT型個體在尾長、尾寬和尾周長上均處于優(yōu)勢,平均值較小,而CCCC型個體尾性狀平均值相較于其他基因型較大。4)分離出的綿羊原代前體脂肪細胞呈不規(guī)則狀或梭型,傳代后仍具有較強增殖能力和分化能力。5)BMP2過表達組中,在m RNA水平,PPARγ和LPL的表達量均有上調(diào),PPARγ在第0天和第1天顯著高于對照組(P0.05),LPL在第1天和第7天極顯著高于對照組(P0.01);蛋白水平各基因差異不明顯。BMP2對體外綿羊前體脂肪細胞的分化有促進影響。6)PDGF-D過表達組中,PPARγ和LPL的表達呈顯著上調(diào)趨勢(P0.05),與對照組相比,PPARγ僅在第0天未達到顯著水平,LPL僅在第3天未達顯著水平。WB結果顯示試驗組PDGF-D、PPARγ表達量較高。PDGF-D對體外前體脂肪細胞的成脂分化具有顯著促進作用。
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S826
【圖文】：

這是前脂肪細胞分化必經(jīng)的生長停滯期（GrowthArrest）（Pairaultetal.,19ire et al., 1998）。生長停滯期的細胞接收到成脂信號后，將重新進入細胞周期，進行多次，細胞此時處于有絲分裂克隆擴增期（Mitotic Clonal Expansion）。研究表明在克隆擴增，發(fā)生 DNA 的復制和染色體結構變化增加了順式元件對作用因子的可接近性，這些作活或抑制決定了與脂肪細胞的分化相關基因的表達（Macdougald et al., 1995）。在細胞增殖后，前脂肪細胞會進入一個新的生長抑制期，稱之為 GD 期（Scott et al., 1982）。的細胞雖然已經(jīng)處于終端分化（Terminal Differentiation）的起始點，但是仍具有去分化入有絲分裂期的能力（Gregoire et al., 1998b; Otto et al., 2005）。此時細胞處于靜息生長脂基因在特異性轉錄因子的調(diào)控下使得靜息生長的細胞進入分化期。此時 C/EBP 和 PPA達且協(xié)同作用來維持分化，使細胞出現(xiàn)成熟脂肪細胞的特征（Tontonoz et al., 1994）。調(diào)節(jié)脂肪細胞分化的轉錄因子脂肪細胞分化為脂肪細胞是一個受眾多轉錄調(diào)節(jié)因子調(diào)控的精密過程。其中，C/EBP γ 在這一過程中有著重要作用，而其他一些轉錄調(diào)節(jié)因子固醇調(diào)節(jié)元件結合蛋白（SREBPel 樣轉錄因子（KLFs）、激活蛋白-1（AP-1）、脂蛋白脂酶（LPL）等也直接或間接的參與化過程（圖 1）。

（5） 多態(tài)位點與尾型的關聯(lián)分析使用SAS 9.2軟件中最小二乘法擬合線性模型，對BMP2和PDGF-D基因的單個多態(tài)位點或合位點與尾型進行關聯(lián)分析。模型中參考的固定效應有場效應和品種效應，隨機效應為基因型應。數(shù)據(jù)以最小二乘均值±標準誤表示。單位點模型：y=μ+G+f+b+e組合位點模型：y=μ+G G G f+b+ey為性狀表型值，μ為群體均值，G為BMP2或PDGF-D基因型效應，f為場效應，b為品種效應。為g.48401272C>A（BMP2）位點的基因型效應，G 為g.48401136C>T（BMP2）位點的基因型應，G 為g.48401272 C>A和g.48401136 C>T兩個位點的交互效應，e為隨機殘差。（6） 生物信息學分析從UCSC網(wǎng)站（https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTables）獲取PDGF-D基因啟動子區(qū)序列JASPAR網(wǎng)站（http://jaspar.binf.ku.dk/cgi-bin/jaspar_db.pl）預測突變前后啟動子區(qū)的轉錄因子結位點是否發(fā)生變化。2.3 結果與分析2.3.1 DNA 提取及 PCR 擴增

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相關碩士學位論文 前1條

1 李青;綿羊BMP2和PDGF-D基因多態(tài)性與尾型的關聯(lián)及細胞水平功能驗證[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2019年

本文編號：2734041