【摘要】：本課題組前期對(duì)國(guó)內(nèi)外綿羊品種進(jìn)行了全基因組重測(cè)序分析,篩選出了一些與綿羊尾型相關(guān)的基因,其中BMP2(骨形態(tài)發(fā)生蛋白2,bone morphogenetic protein 2)和PDGF-D(血小板源性生長(zhǎng)因子D,Platelet-derived growth factor-D)受到強(qiáng)烈選擇。本試驗(yàn)選擇BMP2和PDGF-D作為候選基因,進(jìn)行分子水平和細(xì)胞水平驗(yàn)證,旨在為綿羊尾部脂肪沉積的調(diào)控提供基礎(chǔ)研究資料,為分子育種提供可用的遺傳標(biāo)記。選取藏羊、湖羊兩品種各30個(gè)個(gè)體的基因組樣本分別等量混池,擴(kuò)增BMP2和PDGF-D所有外顯子及基因上下游1000 bp,使用飛行質(zhì)譜對(duì)檢測(cè)到的SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因分型,利用Haploview 4.1軟件進(jìn)行連鎖不平衡分析,使用SAS 9.2軟件將多態(tài)位點(diǎn)與尾型性狀關(guān)聯(lián)分析。同時(shí),從胎羊尾部脂肪組織中分離原代前體脂肪細(xì)胞,對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增獲得細(xì)胞水平驗(yàn)證的原材料。利用慢病毒載體將BMP2和PDGF-D基因穩(wěn)定過(guò)表達(dá)于前體脂肪細(xì)胞中,用胰島素進(jìn)行誘導(dǎo)分化,利用q PCR和WB(Western blot)方法對(duì)脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的標(biāo)記基因脂蛋白脂酶(LPL)和過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)成熟脂肪細(xì)胞油紅O染色觀察脂滴形成情況。得到以下結(jié)果:1)在BMP2基因下游發(fā)現(xiàn)3個(gè)突變位點(diǎn):g.48401619 TA、g.48401272 CA、g.48401136 CT;在PDGF-D基因上游發(fā)現(xiàn)1個(gè)突變位點(diǎn):g.3852134 CT,內(nèi)含子區(qū)發(fā)現(xiàn)1個(gè)位點(diǎn):g.4122606CG。2)BMP2基因的g.48401619 TA、g.48401272 CA和g.48401136 CT位點(diǎn)與尾長(zhǎng)呈顯著相關(guān)(P0.05);PDGF-D基因的g.4122606 CG位點(diǎn)與尾長(zhǎng)顯著相關(guān)(P0.05),g.3852134 CT位點(diǎn)與尾寬顯著相關(guān)(P0.05)。3)BMP2基因的g.48401619 TA、g.48401272 CA和g.48401136 CT三個(gè)位點(diǎn)中,g.48401272CA和g.48401136 CT之間存在強(qiáng)連鎖。構(gòu)成3種單倍型,6種組合基因型。其中CACT型和CCCT型個(gè)體在尾長(zhǎng)、尾寬和尾周長(zhǎng)上均處于優(yōu)勢(shì),平均值較小,而CCCC型個(gè)體尾性狀平均值相較于其他基因型較大。4)分離出的綿羊原代前體脂肪細(xì)胞呈不規(guī)則狀或梭型,傳代后仍具有較強(qiáng)增殖能力和分化能力。5)BMP2過(guò)表達(dá)組中,在m RNA水平,PPARγ和LPL的表達(dá)量均有上調(diào),PPARγ在第0天和第1天顯著高于對(duì)照組(P0.05),LPL在第1天和第7天極顯著高于對(duì)照組(P0.01);蛋白水平各基因差異不明顯。BMP2對(duì)體外綿羊前體脂肪細(xì)胞的分化有促進(jìn)影響。6)PDGF-D過(guò)表達(dá)組中,PPARγ和LPL的表達(dá)呈顯著上調(diào)趨勢(shì)(P0.05),與對(duì)照組相比,PPARγ僅在第0天未達(dá)到顯著水平,LPL僅在第3天未達(dá)顯著水平。WB結(jié)果顯示試驗(yàn)組PDGF-D、PPARγ表達(dá)量較高。PDGF-D對(duì)體外前體脂肪細(xì)胞的成脂分化具有顯著促進(jìn)作用。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S826
【圖文】：

這是前脂肪細(xì)胞分化必經(jīng)的生長(zhǎng)停滯期（GrowthArrest）（Pairaultetal.,19ire et al., 1998）。生長(zhǎng)停滯期的細(xì)胞接收到成脂信號(hào)后，將重新進(jìn)入細(xì)胞周期，進(jìn)行多次，細(xì)胞此時(shí)處于有絲分裂克隆擴(kuò)增期（Mitotic Clonal Expansion）。研究表明在克隆擴(kuò)增，發(fā)生 DNA 的復(fù)制和染色體結(jié)構(gòu)變化增加了順式元件對(duì)作用因子的可接近性，這些作活或抑制決定了與脂肪細(xì)胞的分化相關(guān)基因的表達(dá)（Macdougald et al., 1995）。在細(xì)胞增殖后，前脂肪細(xì)胞會(huì)進(jìn)入一個(gè)新的生長(zhǎng)抑制期，稱之為 GD 期（Scott et al., 1982）。的細(xì)胞雖然已經(jīng)處于終端分化（Terminal Differentiation）的起始點(diǎn)，但是仍具有去分化入有絲分裂期的能力（Gregoire et al., 1998b; Otto et al., 2005）。此時(shí)細(xì)胞處于靜息生長(zhǎng)脂基因在特異性轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控下使得靜息生長(zhǎng)的細(xì)胞進(jìn)入分化期。此時(shí) C/EBP 和 PPA達(dá)且協(xié)同作用來(lái)維持分化，使細(xì)胞出現(xiàn)成熟脂肪細(xì)胞的特征（Tontonoz et al., 1994）。調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄因子脂肪細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞是一個(gè)受眾多轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子調(diào)控的精密過(guò)程。其中，C/EBP γ 在這一過(guò)程中有著重要作用，而其他一些轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（SREBPel 樣轉(zhuǎn)錄因子（KLFs）、激活蛋白-1（AP-1）、脂蛋白脂酶（LPL）等也直接或間接的參與化過(guò)程（圖 1）。

（5） 多態(tài)位點(diǎn)與尾型的關(guān)聯(lián)分析使用SAS 9.2軟件中最小二乘法擬合線性模型，對(duì)BMP2和PDGF-D基因的單個(gè)多態(tài)位點(diǎn)或合位點(diǎn)與尾型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。模型中參考的固定效應(yīng)有場(chǎng)效應(yīng)和品種效應(yīng)，隨機(jī)效應(yīng)為基因型應(yīng)。數(shù)據(jù)以最小二乘均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。單位點(diǎn)模型：y=μ+G+f+b+e組合位點(diǎn)模型：y=μ+G G G f+b+ey為性狀表型值，μ為群體均值，G為BMP2或PDGF-D基因型效應(yīng)，f為場(chǎng)效應(yīng)，b為品種效應(yīng)。為g.48401272C>A（BMP2）位點(diǎn)的基因型效應(yīng)，G 為g.48401136C>T（BMP2）位點(diǎn)的基因型應(yīng)，G 為g.48401272 C>A和g.48401136 C>T兩個(gè)位點(diǎn)的交互效應(yīng)，e為隨機(jī)殘差。（6） 生物信息學(xué)分析從UCSC網(wǎng)站（https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTables）獲取PDGF-D基因啟動(dòng)子區(qū)序列JASPAR網(wǎng)站（http://jaspar.binf.ku.dk/cgi-bin/jaspar_db.pl）預(yù)測(cè)突變前后啟動(dòng)子區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)位點(diǎn)是否發(fā)生變化。2.3 結(jié)果與分析2.3.1 DNA 提取及 PCR 擴(kuò)增

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1 李青;綿羊BMP2和PDGF-D基因多態(tài)性與尾型的關(guān)聯(lián)及細(xì)胞水平功能驗(yàn)證[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2019年

本文編號(hào)：2734041