【摘要】：肉雞心臟、血液循環(huán)系統(tǒng)對氧氣的供應(yīng)滿足不了其快速增長的體重需求是肉雞腹水綜合征(AS)發(fā)生的主要因素,右心肥大繼而衰竭是AS發(fā)生及導(dǎo)致肉雞死亡的重要原因,相關(guān)研究表明心肌細胞凋亡在右心肥大繼而衰竭中起著重要作用。本課題組前期研究表明,肉雞飲水添加牛磺酸能有效減少腹水綜合征的發(fā)病情況,且能降低心肌組織中鈣蛋白酶(Calpains)的活性。目的:本試驗通過缺氧處理原代肉雞心肌細胞,采用�；撬�(Tau)與PD150606(Calpains的一種特異性抑制劑)分別及共同處理的方式,比較探討牛磺酸抗心肌細胞凋亡的作用是否通過影響Calpains的活性來實現(xiàn)。以期為肉雞腹水綜合癥的防治提供理論依據(jù)。方法:分離培養(yǎng)12日齡雞胚心肌細胞,采用細胞免疫化學(xué)方法進行純度鑒定,MTS方法監(jiān)測心肌細胞活力。待心肌細胞生長穩(wěn)定進行分組處理:空白對照組(C)、Tau對照組(CT)、PD150606對照組(CP)、Tau加PD150606對照組(CTP)、缺氧模型組(M)、Tau模型組(MT)、PD150606模型組(MP)、Tau加PD150606模型組(MTP)。Tau及PD150606的藥物添加濃度分別為10 mmol/L、10 umol/L,預(yù)處理時間分別為12 h、0.5 h,缺氧處理時間為12 h。AO/EB檢測各組細胞凋亡情況;熒光探針法檢測各組心肌細胞內(nèi)Ca~(2+)濃度;RT-PCR檢測Calpain-1、Calpain-2、Caspase-9和Caspase-3的mRNA相對表達量;WB檢測Calpain-1、Bcl-2、Cyt-C以及Caspase-9和Caspase-3蛋白相對表達量。試驗結(jié)果如下:1)肉雞胚胎心肌細胞的分離培養(yǎng)與鑒定:本試驗中采用的心肌細胞分離方法,可穩(wěn)定獲得平均純度95%、活力97%的肉雞心肌細胞,試驗周期5天內(nèi)心肌細胞純度穩(wěn)定,能滿足試驗要求。2)Tau對缺氧肉雞心肌細胞凋亡率的影響:單純?nèi)毖跖囵B(yǎng)12 h極顯著提高了心肌細胞的凋亡率(P0.01),Tau及PD150606預(yù)處理都能顯著降低缺氧條件下心肌細胞的凋亡率(P0.05),兩者共同作用效果更佳(P0.01)。3)Tau對缺氧肉雞心肌細胞抗氧化能力及細胞損傷的影響:缺氧培養(yǎng)能提高心肌細胞培養(yǎng)上清中以及細胞內(nèi)的MDA含量(P0.05,P0.05),Tau能減少MDA含量的上升。缺氧能使心肌細胞培養(yǎng)上清中SOD活力較對照組顯著提高(P0.05),添加Tau則使上清及胞內(nèi)SOD活力較M組顯著提高(P0.05,P0.05)。PD150606對缺氧肉雞心肌細胞MDA含量及SOD活力未產(chǎn)生顯著影響,顯著提高了正常培養(yǎng)的細胞內(nèi)的MDA含量(P0.05)。缺氧及Tau對心肌細胞LDH活力無顯著影響,PD150606可使缺氧條件下的上清LDH活力稍提高(P0.05),可使細胞內(nèi)LDH活力下降(P0.05)。4)Tau對缺氧肉雞心肌細胞凋亡相關(guān)基因mRNA相對表達量的影響:缺氧使肉雞心肌細胞Calpain-1、Calpain-2、Caspase-9及Caspasse-3基因的mRNA表達極顯著增高(P0.01)。Tau可顯著抑制缺氧肉雞心肌細胞Calpain-1、Calpain-2(P0.05,P0.01),極顯著抑制Caspase-9及Caspasse-3基因的mRNA表達增高(P0.01,P0.01)。PD150606對Calpains基因的mRNA表達水平無影響,對Caspase-9的抑制能力極顯著低于Tau(P0.01),同時顯著增加了Caspase-3 mRNA表達水平(P0.01)。5)Tau對缺氧肉雞心肌細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響:缺氧使Calpain-1的蛋白表達水平極顯著升高(P0.01),Tau及PD150606均能顯著抑制Calpain-1表達升高(P0.05),但兩者共同作用無抑制效果(P0.05)。缺氧使Bcl-2蛋白相對表達量極顯著下降(P0.01),Tau及PD150606能極顯著維持Bcl-2蛋白水平(P0.01)。缺氧使心肌細胞Cyt-C蛋白極顯著增加(P0.01),Tau能極顯著降低缺氧情況下Cyt-C蛋白量(P0.01),PD150606能顯著降低缺氧情況下Cyt-C蛋白量(P0.05)。M組Caspase-9蛋白表達極顯著高于其他7組(P0.01),Tau及PD150606都能極顯著降低其蛋白表達水平(P0.01),Tau效果顯著高于PD150606(P0.05)。缺氧極顯著降低了M組未剪切Caspase-3的蛋白表達量(P0.01),Tau及PD150606都能顯著減少該降低情況(P0.01,P0.05),兩者共同作用效果最佳;推測缺氧造成Caspase-3蛋白活化,Tau及PD150606都能極顯著減少活化的發(fā)生。綜上所述,在肉雞心肌細胞發(fā)生缺氧損傷時,預(yù)防性應(yīng)用牛磺酸具有提高心肌細胞抗氧化的能力;并通過調(diào)控Calpains的表達顯著抑制了Cyt-C介導(dǎo)的細胞凋亡通路中相關(guān)因子的基因和蛋白表達,有效抑制了心肌細胞凋亡的發(fā)生。因此可以推測:Calpains可通過Cyt-C途徑促進缺氧肉雞心肌細胞凋亡;�；撬峥赏ㄟ^調(diào)控Calpains來實現(xiàn)對缺氧心肌細胞的保護功能,但不局限于該途徑。以上研究結(jié)果為臨床中應(yīng)用�；撬岱乐稳怆uAS提供了理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S858.31
【圖文】：

圖 1 倒置顯微鏡下不同時期的心肌細胞與成纖維細胞igure 1 Myocardial cells and mechanocytes at differdnt times under inverted microsco 倍顯微鏡下心肌細胞培養(yǎng) 24 h 的形態(tài)，心肌細胞已貼壁，但伸展不充分。 B：100 倍顯微鏡下心肌細胞培養(yǎng) 48系增加。C：200 倍顯微鏡下心肌細胞培養(yǎng) 72 h 的細胞形態(tài)，可見明顯的圓形細胞核。D：200 倍顯微鏡下 P2 成態(tài)，細胞貼壁緊密、立體感差，和區(qū)界線不清。E：200 倍顯微鏡下心肌細胞培養(yǎng) 10 d 的部分細胞狀態(tài)，黃色箭的心肌細胞及細胞簇。F：200 倍下 14 d 的部分細胞細胞形態(tài)，底層成纖維細胞生長擠占上層心肌細胞，心肌細縮脫落。 Myocardial cells were cultured for 24 h. B:100× Myocardial cells were cultured for 48 h. C:200× Myocar h. D:200× The second generation mechanocytes were cultured for 24 h. E:200× Myocardial cells were culturelsate cells. F:200× Myocardial cells were cultured for 14 d.驗中曾對 9 到 14 日齡雞胚進行心肌細胞分離培養(yǎng)試驗。結(jié)果表明隨雞心臟體積變大，可獲得心肌細胞數(shù)量增多，但隨日齡的增加分離所得

圖 2 心肌細胞與成纖維細胞對比圖Figure 2 The differents between myocardial cells and mechanocytes 倍顯微鏡下心肌細胞的 α-Sarcomeric actin 一抗陽性鑒定結(jié)果。B：200 倍顯微鏡下用 PBS 代替 α-Sarcomeric ac鑒定結(jié)果，其顯示大小與 C、D 圖一致。C、D：分別為 200 倍顯微鏡下的 A 圖片的放大效果，及放大后負片處

【參考文獻】

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本文編號：2733367