【摘要】：豬圓環(huán)病毒3型(PCV3)是一種新型豬圓環(huán)病毒,于2016年首次發(fā)現(xiàn),流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)PCV3經(jīng)常感染患有PDNS和繁殖障礙癥狀的豬群,由于豬圓環(huán)病毒3型已在世界上流行,因此快速準(zhǔn)確地診斷豬群的感染狀態(tài)對(duì)于預(yù)防和控制該疾病具有非常重要的意義。本文利用PCR擴(kuò)增PCV3保守基因片段(152bp),將其克隆到pMD-19T載體上,構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD19T-PCV2-Cap作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒(同時(shí)作為兩種熒光定量PCR檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒),并對(duì)其進(jìn)行敏感性、特異性和重復(fù)性驗(yàn)證。結(jié)果如下:1.SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR:標(biāo)準(zhǔn)品在4.5×1010～4.5×103拷貝/μ L范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系,其相關(guān)系數(shù)為0.998,斜率為3.448;特異性強(qiáng)與PRRSV、PCV2、PPV、JEV及PRV均無(wú)交叉反應(yīng),敏感性為4.5×103拷貝/μL,與常規(guī)PCR方法相比高出10倍,組間和組內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于2%;采用SYBR Green Ⅰ PCR檢測(cè)435份豬場(chǎng)血清樣品,陽(yáng)性率為65.7%,高于普通PCR陽(yáng)性檢測(cè)率的51.7%,表明建立的PCV3 SYBR Green Ⅰ PCR方法敏感、特異,可用于豬場(chǎng)PCV3感染的快速檢測(cè)。因TaqMan具有更好的特異性,本研究建立了基于TaqMan探針的熒光定量PCR檢測(cè)方法,并對(duì)這批樣品進(jìn)行了檢測(cè)。2.TaqMan熒光定量PCR:標(biāo)準(zhǔn)品在4.5×1011～4.5×103拷貝/μL范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系,其相關(guān)系數(shù)為1,斜率為3.982;特異性強(qiáng),敏感性為4.5×102拷貝/μL,組間和組內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于2%;利用TaqMan熒光定量PCR對(duì)435份豬場(chǎng)血清樣品進(jìn)行檢測(cè),得出陽(yáng)性率為70.11%,高于普通PCR陽(yáng)性檢測(cè)率的51.7%,說(shuō)明建立的TaqMan熒光定量PCR方法成功。3.5株P(guān)CV3全基因序列分析:通過(guò)本研究所建立的熒光定量方法檢測(cè)吉林省部分豬組織樣品,并擴(kuò)增其全序列,測(cè)序鑒定正確后,獲得5株P(guān)CV3全基因序列。通過(guò)遺傳進(jìn)化與核苷酸同源性分析,5株毒株之間的核苷酸同源性為98.7%～99.5%,與國(guó)內(nèi)20株P(guān)CV3序列核苷酸同源性為98.7%～100%,與國(guó)外10株P(guān)CV3序列同源性為98.4%～99.6%。本文所建立的兩種熒光定量方法可用于PCV3的檢測(cè)及流行病學(xué)調(diào)查,為防治PCV3奠定基礎(chǔ);對(duì)PCV3全基因組進(jìn)行擴(kuò)增,并進(jìn)行相應(yīng)分析,為PCV3的流行趨勢(shì)研究提供一定的依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：延邊大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S858.28
【圖文】：

圖１邋ＰＣＶ３基因結(jié)構(gòu)逡逑Ｆｉｇ．ｌ邋ＰＣＶ３邋ｇｅｎｏｍｅ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ逡逑３主要結(jié)構(gòu)蛋白及其功能逡逑要有ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３這三個(gè)開(kāi)放閱讀框組成；ＯＲＦ，在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)，可誘導(dǎo)其發(fā)生特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)。Ｏ；當(dāng)下對(duì)ＯＲＦ３的功能，并沒(méi)有得出任何結(jié)論ＰＣＶ２白同源性較低，這也就可以說(shuō)明了其兩者間出現(xiàn)交叉免的，或者也可以說(shuō)是兩者之間是沒(méi)有交叉免疫保護(hù)性的。逡逑分離逡逑能在原代豬腎細(xì)胞、ＢＨＫ－２１細(xì)胞等上生長(zhǎng)，只能在ＰＫ－１。逡逑３診斷方法逡逑３是在患ＰＤＮＳ的母豬以及它的流產(chǎn)胎兒體內(nèi)檢測(cè)得到ＰＣＶ３的患病豬其臨床癥狀和病理變化都和ＰＣＶ２引起

對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒ｐＭＤ］９Ｔ－Ｃａｐ進(jìn)行１０倍倍比稀釋?zhuān)x擇其中的逡逑ＵｘｌＯＨＭ＾Ｈ＾ｃｏｐｉｅｓ／ｐｌ邋進(jìn)行邋ＳＹＢＲ邋Ｇｒｅｅｎ邋Ｉ邋Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ邋ＰＣＲ邋擴(kuò)增。結(jié)果如下圖逡逑（圖３）顯示，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)其斜率為３．４４８，截距為４８．７１８，相關(guān)系數(shù)為０．９９８。本逡逑研宄所建立的ＳＹＢＲ邋Ｇｒｅｅｎ邋Ｉ邋Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ邋ＰＣＲ方法具有較高的擴(kuò)增效率。陰性未出逡逑現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。溶解曲線(xiàn)只有單一峰值，陰性無(wú)峰值。逡逑

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