【摘要】：DLK1(delta like non-canonical Notch ligand 1)基因是位于哺乳動(dòng)物DLK1-DIO3印記區(qū)域內(nèi)一個(gè)父源表達(dá)的印記基因;該基因常被用作前脂肪細(xì)胞的標(biāo)志基因,也被稱為前體脂肪細(xì)胞因子(preadipocyte factor 1)。前期研究表明,DLK l可促進(jìn)哺乳動(dòng)物肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育,對(duì)脂肪組織的生長(zhǎng)發(fā)育卻表現(xiàn)不同程度的抑制作用。但是DLK1在脂肪細(xì)胞不同分化階段的差異表達(dá)豐度對(duì)牛機(jī)體發(fā)育過(guò)程中脂肪酸合成、甘油三酯的沉積和胴體性狀是否亦具有負(fù)向調(diào)控作用尚不清楚。本試驗(yàn)通過(guò)肉牛群體和細(xì)胞水平對(duì)DLK1調(diào)控脂肪代謝作用進(jìn)行了研究分析,為進(jìn)一步解析DLK1的功能及應(yīng)用于肉牛分子輔助育種提供技術(shù)依據(jù)。本試驗(yàn)以中國(guó)西門塔爾牛為研究對(duì)象,測(cè)定了325頭中國(guó)西門塔爾牛的胴體與肉質(zhì)性狀及牛脂肪酸,采用測(cè)序和PCR-RFLP的方法分析DLK1基因的遺傳多態(tài)性,進(jìn)一步探討DLK1基因?qū)θ馀ｋ伢w和肉質(zhì)性狀的相關(guān)關(guān)系,旨在為從遺傳學(xué)角度探討基因標(biāo)記輔助選擇,以期應(yīng)用于肉牛的分子育種。為深入了解DLK1對(duì)脂肪合成代謝的作用和調(diào)控機(jī)制,本試驗(yàn)構(gòu)建基因過(guò)表達(dá)載體pBI-CMV3-DLK1和干擾載體pGPU6/GFP/Neo-shRNA,在牛胎兒成纖維細(xì)胞中檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量的影響,旨在揭示候選基因在細(xì)胞水平上對(duì)脂肪代謝通路中甘油三酯合成的作用。結(jié)果顯示,在牛DLK1基因的功能區(qū)序列中篩查到兩個(gè)SNP位點(diǎn)I3-478 CT和I3-609 TG。與中國(guó)西門塔爾肉牛的胴體、肉質(zhì)性狀和脂肪酸組成相關(guān)性分析的結(jié)果表明,I3-478 CT位點(diǎn),攜帶突變純合基因型(TT)個(gè)體表現(xiàn)出較高的胴體重、腎臟脂肪重、脂肪覆蓋率和腰部肉厚(p0.05),攜帶突變雜合基因型(CT)個(gè)體在脂肪覆蓋率和大理石花紋性狀方面極顯著高于CC基因型個(gè)體(p0.01)。I3-609 TG位點(diǎn),攜帶突變雜合基因型(TG)個(gè)體表現(xiàn)出較高的脂肪覆蓋率和腎臟脂肪含量(p0.05),攜帶突變純合基因型(GG)個(gè)體的脂肪顏色極顯著優(yōu)于TT基因型個(gè)體(p0.01)。SNP位點(diǎn)與脂肪酸組成的相關(guān)性分析表明,DLK1基因的I3-478 CT位點(diǎn)中的CT基因型與CC基因型的個(gè)體在亞油酸和α亞麻酸含量中呈現(xiàn)顯著相關(guān)關(guān)系(p0.05),在花生酸中呈現(xiàn)極顯著相關(guān)關(guān)系(p0.01)。I3-609 TG位點(diǎn)中的TT基因型與TG基因型的個(gè)體在亞油酸、α亞麻酸、花生酸和花生四烯酸含量中呈現(xiàn)顯著相關(guān)關(guān)系(p0.05)。表明DLK1基因功能區(qū)域的SNPs與中國(guó)西門塔爾牛部分胴體、肉質(zhì)性狀和脂肪酸組成具有相關(guān)性。在牛胎兒成纖維細(xì)胞中,進(jìn)行DLK1基因的過(guò)表達(dá)和沉默后檢測(cè)細(xì)胞脂肪合成通路中甘油三酯的變化。結(jié)果表明,DLK1基因在細(xì)胞中高表達(dá)能顯著降低細(xì)胞中甘油三酯的含量;而當(dāng)細(xì)胞中DLK1基因表達(dá)沉默時(shí),細(xì)胞中甘油三酯合成量有上升趨勢(shì)。綜上所述,前脂肪細(xì)胞因子DLK1基因功能區(qū)域存在的SNPs:I3-478CT和I3-609 TG與中國(guó)西門塔爾肉牛部分胴體、肉質(zhì)性狀和肌內(nèi)脂肪酸組成存在顯著相關(guān)性;同時(shí)DLK1基因?qū)εＬ撼衫w維細(xì)胞中甘油三酯的合成具有一定負(fù)向調(diào)控作用。本試驗(yàn)研究結(jié)果可為進(jìn)一步研究DLK1的功能及應(yīng)用于肉牛分子輔助選擇和良種選育提供試驗(yàn)依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S823
【圖文】：

國(guó)西門塔爾�；� DNA 進(jìn)行用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)泳圖 1.1 可見(jiàn)，電泳條帶清晰，無(wú)明顯拖尾和抹。對(duì) DNA 樣品濃度檢測(cè)的結(jié)果顯示，基因值均在 1.8 左右，濃度約為 600 ng/μL，表明提質(zhì)的污染。圖 1.1 牛血液基因組 DNA 電泳結(jié)果garose gel electrophoresis’s result of bovine blood g泳道 1 為 DL 2000 Marker，泳道 2、3、4 為牛全基因組池?cái)U(kuò)增結(jié)果顯示各產(chǎn)物條帶明亮、清晰，無(wú)引物二聚體、無(wú)抹1 擴(kuò)增的 PCR 產(chǎn)物大小約為 885 bp，引物 2 擴(kuò)增引物 3 擴(kuò)增的 PCR 產(chǎn)物大小約為 489 bp，且擴(kuò)增

圖 1.2 DLK1 基因 PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig 1.2 The result of PCR amplification of DLK1 gene注：M：DL 2000 DNAMarker, 泳道 1～3：PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果。A 為引物 1 PCR 擴(kuò)增結(jié)果圖，B 為引物 2 PCR 擴(kuò)增結(jié)果圖，C 為引物 3 PCR 擴(kuò)增結(jié)果圖1.2.3 DNA 混池測(cè)序結(jié)果從這 9 種 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果中，僅在引物 3 中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)明顯套峰，測(cè)序結(jié)果如圖 1.3。這兩個(gè)突變都位于內(nèi)含子 3 上，分別是 I3-478bp（Ensemblrs378555311）處，478C 突變?yōu)?T；序列的第 I3-609bp（Ensembl rs381186600）處，609 T 突變?yōu)?G。使用 primer5.0 軟件篩查引物 3 擴(kuò)增的序列中 I3-478 C>T 位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶為 Msp I，該酶限定的切割堿基為 C^CGG;篩查 I3-609 T>G 位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶為 Ase I，該酶限定的切割堿基為 AT^TAAT。BAC

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本文編號(hào)：2728080