【摘要】：畜禽的產(chǎn)肉潛力與其肌纖維數(shù)量密切相關(guān),而動(dòng)物胚胎發(fā)育后期和動(dòng)物出生后,肌纖維數(shù)量基本已固定。胚胎肌肉發(fā)生主要依賴于成肌細(xì)胞的增殖和分化,其增殖和分化的能力很大程度上能夠決定動(dòng)物出生后的肌纖維數(shù)量。為了探討家禽骨骼肌發(fā)育的受調(diào)控情況,特別是由成肌細(xì)胞向肌管分化的過程,本研究以雞為研究對(duì)象,以雞原代成肌細(xì)胞為工具,利用RNA-seq技術(shù)對(duì)雞原代成肌細(xì)胞分化過程中的mRNA、lncRNA和miRNA進(jìn)行鑒定和分析,主要結(jié)果如下:研究一:分離培養(yǎng)雞原代成肌細(xì)胞并誘導(dǎo)分化,利用RNA-seq技術(shù)分析成肌分化第0、1、3和5天的lncRNAs和mRNAs表達(dá)情況,結(jié)合生物信息學(xué)分析方法,鑒定在成肌分化過程中表達(dá)的lncRNAs,預(yù)測(cè)其可能的生物學(xué)功能。同時(shí)篩選成肌分化過程中的差異表達(dá)lncRNAs和mRNAs,進(jìn)行K-means表達(dá)聚類分析。1、共鑒定出2,484條lncRNAs,其中包括2,285條基因間區(qū)長鏈非編碼RNAs和199條反義長鏈非編碼RNAs。這些lncRNAs在染色體上的分布具有明顯的偏好性,1號(hào)染色體上分布最多(367)。與雞已知的蛋白編碼基因相比,lncRNAs具有更短的轉(zhuǎn)錄本、ORF長度以及更少的外顯子數(shù)。2、選取lncRNA上下游10kb范圍內(nèi)的蛋白編碼基因?yàn)槠鋍is作用的靶基因,結(jié)果在1,530個(gè)lncRNAs附近共發(fā)現(xiàn)2,041個(gè)蛋白編碼基因。功能富集分析顯示,雞原代成肌細(xì)胞分化過程中的lncRNAs在多條骨骼肌發(fā)育相關(guān)的通路中顯著富集,如肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、胰島素信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路以及黏著斑。3、以皮爾森相關(guān)系數(shù)為篩選依據(jù)(r0.95或r-0.95,p0.05),選擇與lncRNAs顯著相關(guān)的蛋白編碼基因?yàn)槠鋞rans作用的靶基因,結(jié)果發(fā)現(xiàn)990個(gè)lncRNAs與7,436個(gè)蛋白編碼基因顯著相關(guān),78,202對(duì)為正相關(guān)關(guān)系,27,724對(duì)為負(fù)相關(guān)關(guān)系。功能富集分析顯示,雞原代成肌細(xì)胞分化過程中的lncRNAs主要被富集在細(xì)胞周期、黏著斑、p53信號(hào)通路以及細(xì)胞外基質(zhì)受體互作等生物學(xué)通路,參與成肌細(xì)胞增殖、分化和融合過程。4、在雞原代成肌細(xì)胞分化過程中共篩選到906個(gè)差異表達(dá)lncRNAs和4,422差異表達(dá)mRNAs。功能富集分析顯示,差異表達(dá)基因主要富集在骨骼肌分化、有絲分裂、細(xì)胞遷移和粘附等相關(guān)的生物學(xué)進(jìn)程,同時(shí)發(fā)現(xiàn)多個(gè)成肌分化相關(guān)通路,如ECM受體互作、黏著斑、DNA復(fù)制、細(xì)胞粘附分子、細(xì)胞周期、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)控、PPAR信號(hào)通路等。5、對(duì)差異表達(dá)基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行K-means聚類分析,最終將4,422個(gè)差異表達(dá)基因聚為4個(gè)類別(命名為K1、K2、K3和K4)。功能富集分析表明,K1可能在成肌細(xì)胞增殖或由增殖過渡到分化過程發(fā)揮重要作用;K4可能與成肌細(xì)胞分化啟動(dòng)或初始分化密切相關(guān);K2和K3則可能與成肌細(xì)胞遷移、粘附以及融合有關(guān)。研究二:基于cis靶基因預(yù)測(cè),聯(lián)合差異表達(dá)基因數(shù)據(jù),構(gòu)建lncRNA-mRNA互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò),篩選參與雞骨骼肌發(fā)育調(diào)控的潛在候選因子;以雞原代成肌細(xì)胞分化過程中的差異表達(dá)lncRNAs和差異表達(dá)mRNAs為數(shù)據(jù)源進(jìn)行WGCNA分析,鑒定成肌分化過程中的功能模塊,篩選調(diào)控雞骨骼肌分化的重要候選因子。1、構(gòu)建差異表達(dá)lncRNAs及其共表達(dá)cis作用靶基因間的互作網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)中l(wèi)ncRNAs主要被富集在肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、ErbB信號(hào)通路和胰島素信號(hào)通路,參與骨骼肌分化、有絲分裂、細(xì)胞遷移和粘附等相關(guān)的生物學(xué)進(jìn)程。SIX2、PAK3、HACD1、SULF1、SOCS1、MFW2、SIK1、CFL2、AC7C1、TNNI2等以及與它們關(guān)聯(lián)的lncRNAs可被視為參與調(diào)控雞骨骼肌發(fā)育的重要候選分子。2、WGCNA分析鑒定到6個(gè)與有絲分裂、肌細(xì)胞分化、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)、能量代謝、細(xì)胞遷移和粘附等GO分類密切相關(guān)的基因模塊。模塊中高連通性樞紐基因可能對(duì)骨骼肌發(fā)育具有潛在的重要作用,包括TRIM55、DES、FAM65B、ACTC1、TNNI2、FEN1、AIF1L、ALDBGALT0000002581、NEK6、FAR-1 等。研究三:利用RNA-seq技術(shù)獲得成肌分化過程中miRNA的表達(dá)譜。結(jié)合生物信息學(xué)分析方法,鑒定在成肌分化過程中表達(dá)的miRNAs,預(yù)測(cè)其可能的生物學(xué)功能。同時(shí),整合差異表達(dá)miRNAs和mRNAs表達(dá)數(shù)據(jù),輔以多種功能性分析和互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建軟件進(jìn)行miRNA-mRNA聯(lián)合分析,篩選參與雞骨骼肌發(fā)育調(diào)控的潛在候選因子。1、共鑒定出712個(gè)miRNAs成熟體,對(duì)應(yīng)584個(gè)miRNA前體,屬于123個(gè)miRNAs家族,此外還鑒定到224個(gè)新miRNAs。2、雞原代成肌細(xì)胞中miRNA的表達(dá)量普遍較低,其中TPM在1-10的miRNAs數(shù)目占總miRNAs數(shù)量的85.32%以上,大于10,000的miRNAs僅占1.4%左右。3、每個(gè)文庫表達(dá)豐度前15共19個(gè)miRNAs的靶標(biāo)通路分析表明,介導(dǎo)靶向抑制參與雞原代成肌細(xì)胞分化調(diào)控的功能性miRNAome可能很小且趨于高表達(dá)。4、對(duì)成肌細(xì)胞不同分化階段的miRNA表達(dá)進(jìn)行差異表達(dá)分析,共鑒定出298個(gè)DEMs。相鄰階段DEMs功能富集分析顯示,DEMs在骨骼肌發(fā)育、有絲分裂、細(xì)胞遷移和粘附相關(guān)的通路顯著富集。5、構(gòu)建差異表達(dá)miRNAs及其差異表達(dá)靶基因間的互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò),篩選到多個(gè)參與雞骨骼肌發(fā)育調(diào)控的潛在候選因子,如miR-206、miR-133b、miR-204、miR-214、miR-7、miR-7b、miR-146b-5p、miR-222b-5p、miR-10a-5p、miR-203a、miR-10b-5p、miR-34a-5p、miR-218-5p、CDK6、AOX1、FSTL1、SESN1、TIMP2 等。
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S831

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本文編號(hào)：2728032